STIM2.3 : An evolutionary late regulator of intra

Abstract

Calcium (Ca2+) regulates as a highly versatile second messenger a variety of short-term as well as long-term cellular processes such as gene transcription, muscle contraction and apoptosis. Store-operated Ca2+ entry (SOCE) regulates basal and receptor-triggered Ca2+ signaling with STIM (stromal interaction molecule) proteins sensing the endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ content and triggering Ca2+ entry by gating ORAI channels in the plasma membrane (PM) in response to store depletion. This study identified and characterized the splice variant STIM2.3, which arises with the evolution of hominoids ~20 million years ago. In STIM2.3, insertion of a short exon results in a translated protein lacking the C-terminal serine/proline rich region, the microtubule-associated EB binding sites, and the polybasic domain (PBD), which functions as an ER retention signal and anchors STIM proteins at phospholipids at the inner leaflet of the PM. STIM2.3 showed the highest expression in human cerebellum as analyzed from different postmortem human brain regions by quantitative RT-PCR. Ca2+ imaging experiments revealed a STIM2.3-mediated gain-of-function SOCE phenotype, which is encoded by the larger C-terminal deletion and not by the splice-specific residues. However, deletion of only the PBD (STIM2.25K) in full-length STIM2 abolished SOCE, which was rescued by the simultaneous mutation of both EB binding motifs (STIM2.2 2xIP+5K). These results demonstrate competitive functions of plasma membrane anchoring and microtubular tracking on STIM2 function. Despite the lack of the PBD, STIM2.3 showed ER distribution at rest and colocalized with STIM1 and STIM2.2 in regions near the nucleus but did not show pre-clustering as STIM2.2 at ER PM junctions under basal conditions. Full store depletion abolished differences in colocalization, however, deletion of the PBD significantly reduced Tg-induced cluster formation and size in STIM2.3, STIM2.25K and STIM2.2 2xIP+5K in the absence of endogenous STIM despite their differential SOCE phenotypes. While deletion of STIM1 and/or STIM2 using CRISPR/Cas9 in the neuroblastoma cell line SH-SY5Y significantly increased voltage-gated Ca2+ influx, transient over-expression of either STIM2.1, STIM2.2 or STIM2.3 did not significantly reduce K+-induced Ca2+ influx. However, neuronal differentiation of SH-SY5Y cells using retinoic acid and BDNF demonstrated a reciprocal negative feedback regulation of voltage-gated and store-operated Ca2+ influx.

Kalzium (Ca2+) reguliert als sekundärer Botenstoff eine Vielzahl an zellulären Prozessen wie Transkription, Muskelkontraktion und Apoptose. Beim speichergesteuerten Kalziumeinstrom (SOCE) aktivieren STIM-Proteine als ER-ständige Kalziumsensoren in Abhängigkeit der luminalen Kalziumkonzentration die in der Plasmamembran (PM) lokalisierten ORAI-Proteine, die den Ca2+-selektiven CRAC-Kanal bilden. In dieser Arbeit wurde die STIM2 Spleißvariante STIM2.3, die mit Evolution der Hominoiden vor etwa 20 Millionen Jahren entstand, funktionell charakterisiert. Im Vergleich zum konventionellen STIM2 (hier STIM2.2 genannt) führt die Insertion eines kurzen Exons in STIM2.3 zu einem STIM2-Protein, dem die C-terminale Serin/Prolin-reiche Region, die Mikrotubuli-assoziierte Bindestelle sowie die polybasische Domäne (PBD) fehlen. Letztere fungiert als ER-Retentionssignal und verankert STIM-Proteine an Phospholipiden innerhalb der PM. Das STIM2.3-spezifische Exon konnte in verschie-denen humanen postmortem Gehirnregionen nachgewiesen werden und zeigte zusammen mit ORAI2 die höchste Expression im Cerebellum. Die funktionelle Charak-terisierung mittels Ca2+-Imaging-Experimenten in unterschiedlichen Zelllinien zeigte, dass STIM2.3 zu einem erhöhten Kalziumeinstrom führt. Während der STIM2.3-spezifische SOCE-Phänotyp durch Deletion der C-terminalen Aminosäuren 675-833 reproduziert werden konnte, führte die Deletion der PBD (5K) in STIM2.2 zu einem signifikant reduzierten SOCE, welcher durch die simultane Mutation beider EB-Bindemotive wiederhergestellt werden konnte (5K+2xIP). Trotz der fehlenden PBD zeigte STIM2.3 eine Lokalisation innerhalb des ERs und kolokalisierte mit STIM1 und STIM2.2 in Zellkern-nahen Regionen. Allerdings zeigte STIM2.3 im Gegensatz zu STIM2.2 keine Präcluster in Plasmamembran-nahen Bereichen. Während eine voll-ständige Speicherentleerung Unterschiede in der Kolokalisation beseitigte, zeigten alle STIM2-Proteine, denen die PBD fehlte, eine reduzierte Clustergröße nach Stimulation mit Thapsigargin in Abwesenheit von endogenen STIM-Proteinen. Während die Deletion von STIM1 und STIM2 mittels CRISPR/Cas9 in der Neuroblastoma Zelllinie SH-SY5Y den spannungsgesteuerten Kalziumeinstrom erhöhte, führte die transiente Expression von STIM2.1, STIM2.2 oder STIM2.3 zu keiner signifikanten Reduktion des K+-induzierten Kalziumpeaks. Die neuronale Differenzierung der SH-SY5Y-Zelllinien unter Verwendung von Retinsäure und BDNF zeigte jedoch eine negative Feedback-Regulation des spannungs- und speichergesteuerten Kalziumeinstroms. Zusätzlich wurde der Effekt von STIM2.3 auf die Aktivierung des Ca2+-abhängigen Transkriptionsfaktors NFAT untersucht. Während die Expression von STIM2.2 in SH-SY5Y STIM1/STIM2-/--Zellen bereits zu einer basalen NFAT-Translokation in den Zellkern führte, konnte eine STIM2.3-vermittelte NFAT-Aktivierung erst nach Speicher-entleerung beobachtet werden. Zudem ist die PBD nicht unbedingt für die Tg-induzierte STIM2-vermittelte NFAT-Aktivierung erforderlich, sofern die Bindestellen der Mikrotubuli-assoziierten Proteine fehlen. Sie ist vielmehr für die Rekrutierung und Stabilisierung des NFAT-Signalkomplexes unter Bedingungen mit niedriger Agonist-konzentration verantwortlich. Des Weiteren zeigte STIM2.3 eine reduzierte Interaktion mit und gleichzeitig reduzierte Aktivierung des Energiesensors AMPKα in Ko-Immun-präzipitationsexperimenten. Um mögliche physiologische Funktionen von STIM2.3 in einem mehr neuronalen Zellsystem zu untersuchen, wurde eine stabile SH-SY5Y STIM2-/--Zelllinie generiert, die STIM2.3 stabil überexprimiert. RNA-Sequenzierung und die nachfolgende Gen-Ontologie-Analyse identifizierte mehrere signifikant hochregulierte neuronale Prozesse wie Neurogenese, Axonogenese, Gehirnentwicklung und Axonentwicklung. Diese Ergebnisse in Kombination mit den Expressionsdaten deuten darauf hin, dass das Spleißen von STIM2.3 mit der evolutionär wachsenden Cerebellumgröße in menschen-artigen Affen sowie der Entwicklung feinmotorischer Fähigkeiten und Sprache in Zusammenhang stehen könnte. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit mit der funktionellen Charakterisierung der C-terminal verkürzten SOCE-Komponente STIM2.3 ein neuer Regulator der intra-zellulären Kalziumhomöostase identifiziert werden.