Bitte benutzen Sie diese Referenz, um auf diese Ressource zu verweisen: doi:10.22028/D291-41477
Titel: Einfluss von Retinoiden und Retinoid-Rezeptor-Antagonisten auf die humanen Limbusepithelzelllinien L-TERT und L-W (PAX6+/-)
VerfasserIn: Parow, Frederika Marie
Sprache: Deutsch
Erscheinungsjahr: 2023
Erscheinungsort: Homburg/Saar
DDC-Sachgruppe: 000 Allgemeines, Wissenschaft
500 Naturwissenschaften
610 Medizin, Gesundheit
Dokumenttyp: Dissertation
Abstract: Zusammenfassung (Deutsch) Hintergrund und Ziele Die PAX6-Haploinsuffizienz-assoziierte Aniridie ist eine seltene panokuläre Erkrankung, die unter anderem mit Limubsstammzellinsuffizienz und Aniridie-assoziierter Keratopathie einhergeht und die Sehkraft entscheidend mindern kann. Aufgrund einer verminderten Paired-Box-Protein 6 (PAX6)-Genexpression ist vor allem die Differenzierung von Limbusepithelzellen (LEZ) zu kornealen Epithelzellen gestört. Als Ursache dafür werden Störungen im Retinolstoffwechsel und dessen Signalwege vermutet, da Gene (wie Fettsäurebindendes Protein 5 (FABP5) und Alkoholdehydrogenase 7 (ADH7)) dieser Wege in PAX6+/--LEZ ebenfalls vermindert exprimiert werden und ein Überangebot an Retinsäure zu einem Aniridie-ähnlichen Genprofil führt, in dem Gene wie Desmolgein 1 (DSG1), Keratin 3 (KRT3) und Serinproteiase-Inhibitor vom Kazal-Typ 7 (SPINK7) herunterreguliert sind. Anirdie-Primärzellen sind sehr selten zugänglich, weshalb vergleichbare Studien zu diesem Thema bisher nur an Zellmodellen durchgeführt werden konnten. Nun soll geprüft werden, ob sich die immortalisierten Zelllinien L-TERT und L-W für zukünftige Studien eignen. Material und Methoden Die Zelllinien L-TERT und L-W wurden in Keratinozyten Serumfreiem Medium (KSFM) kultiviert und nach Erreichen von 90%-iger Konfluenz für 24h mit Retinoiden (Retinol oder at-Retinsäure) oder Retinoidrezeptorantagonisten (AGN oder UVI) inkubiert. Anschließend wurden mittels qPCR folgende Transkripe analysiert: die Stammzell- und Differenzierungsmarker PAX6, ADH7 und SPINK7; Strukturproteine und Adhäsionsmarker DSG1, Keratin 12 (KRT12), KRT3 und KRT19; die Retinolstoffwechsel-relevanten Marker FABP5, Peroxisomen-Proliferator-aktivierter Rezeptor (PPARG) und Fettsäure-Elongase 7 (ELOVL7); und zuletzt der Proliferationsmarker MKI67. Zusätzlich wurden die Proteinmengen von PAX6 und FABP5 mittels eines Western-Blots anaylsiert. Ergebnisse Signifikante Unterschiede in der basalen Genexpression der Zelllinien zeigten sich bei nur PAX6 (at-RA p=0,0001, Ret p<0,0001, AGN<0,0001, UVI p<0,0001) und KRT19 (at-RA p=0,0052, Ret p=0,0006, AGN p=0,0007, UVI p=0,0060). L-TERT-LEZ enthielten mehr PAX6, dafür aber weniger KRT19 als L-W. Die Proteinmenge in L-TERT war sowohl bei PAX6 (at-RA p<0,0001, Ret p=0,0006, AGN p=0,0010, UVI p=0,0149) als auch bei FABP5 (at-RA p=0,0272, AGN p=0,0056) signifikant höher als in L-W. Auf Behandlung mit Retinoiden oder Retinoidrezeptorantagonisten reagierten die Zelllinien generell nur sehr schwach. Signifikant verändert war die Genexpression von PAX6 in L-TERT bei Behandlung mit Retinoiden (Hochregulierung, at-RA p=0,0005, Ret p=p,0012) und bei Behandlung mit Retinoid-Rezeptor-Antagonisten (Herunterregulierung, AGN p=0,0124, UVI p=0,0305). Sowohl in L-TERT als L-W zeigten sich signifikante Effekte der Behandlung für die Genexpression von FABP5 (L-TERT: Hochregulierung bei at-RA p=0,0451, L-W: Herunterregulierung bei UVI p=0,0417, L-TERT und L-W: Herunterregulierung bei AGN p=0,0498 (L-TERT) und p<0,0265 (L-W)) sowie PPARG (L-TERT: Hochregulierung bei at-RA p=0,0057, Ret p=0,0388 und AGN p=0,0251, L-W: Hochregulierung bei UVI p=0,0429). KRT19 war bei Behandlung mit Retinoiden (Hochregulierung, p<0,0488) und RAR/RXR-Antagonisten (Herunterregulierung, p<0,0428) nur in L-W signifikant verändert exprimiert. Nur vereinzelt veränderten sich die Genexpression von ADH7 (L-W: Hochregulierung bei UVI p=0,0229), DSG1 (L-TERT: Hochregulierung bei AGN p=0,0189) und ELOVL7 (L-TERT: Hochregulierung bei AGN p=0,0022). Auf SPINK7 (p>0,1243), KRT3 (p>0,2173) sowie MKI67 (p>0,1342) hatte die Behandlung mit Retinoiden oder RAR/RXR-Antagonisten keinen Effekt. Auf Proteinebene zeigten sich ebenfalls nur vereinzelt Effekte der Behandlung bei PAX6 (at-RA: Herunterregulierung bei L-TERT p=0,0018 und L-W p=0,0055, AGN: Herunterregulierung bei L-TERT p=0,0010). Die Proteinexpression von FABP5 veränderte sich nicht bei Behandlung (p>0,1677). Zelllinienspezifische Effekte der Behandlung auf die Genexpression zeichneten sich lediglich bei DSG1 (AGN p=0,0055) und PPARG (at-RA p=0,0479 und AGN p=0,0108), und auf die Proteinexpression nur bei PAX6 (AGN p=0,0285). Schlussfolgerungen Die Zelllinien L-TERT und L-W eignen sich nicht als alternatives Model zu primären LEZ und Aniridie-LEZ um vergleichend Einflüsse des Retinolstoffwechsels auf gesunde sowie PAX6+/--LEZ zu untersuchen. L-TERT und L-W sind sich in ihrer Genexpression zu ähnlich, was möglicherweise an einem zu geringen PAX6-Gehalt in beiden Zellen liegen könnte. Die PAX6-Expression in L-TERT war zwar höher als in L-W, aber im Vergleich zu primären LEZ entspricht die PAX6-Expression nur etwa einem Viertel.
Background and purpose PAX6 haploinsufficiency-associated aniridia is a rare panocular disease associated with limbal stem cell insufficiency and aniridia-related keratopathy, which may critically reduce vision. Due to decreased PAX6 gene expression, the differentiation of limbal epithelial cells (LECs) into corneal epithelial cells is particularly impaired. Its reason may be disturbances in retinol metabolism and signaling, as expressionof signaling components (such as FABP5 and ADH7) in PAX6+/--LECs is also decreased and an oversupply of retinoic acid leads to an aniridia-like gene profile, with downregulation of DSG1, KRT3 and SPINK7 genes. Aniridia primary cells are hardly accessible, therefore, comparative studies related to this topic have mainly been performed using cell models so far. In the present study, we aimed to analyse, how the immortalized limbal cell lines L-TERT and L-W are suitable for future studies, related to AAK. Materials and methods L-TERT and L-W were cultured in keratinocyte serum-free medium and were incubated to retinoids (retinol or retinoic acid) or retinoid receptor antagonists (AGN or UVI) for 24 hours after reaching 90% confluence. Subsequently, using qPCR, expression of the stem cell and differentiation markers PAX6, ADH7 and SPINK7; the structural proteins and adhesion markers DSG1, KRT12, KRT3 and KRT19; the retinol metabolism-related markers FABP5, PPARG and ELOVL7; and lastly the proliferation marker MKI67 have been alalysed. In addition, PAX6 and FABP5 protein levels have been determined by WesternBlot. Results Significant differences in gene expression between L-TERT and L-W cell lines were only observed for PAX6 (at-RA p=0.0001, Ret p<0.0001, AGN<0.0001, UVI p<0.0001) and KRT19 (at-RA p=0.0052, Ret p=0.0006, AGN p=0.0007, UVI p=0.0060). There was a higher PAX6 and a lower KRT19 expression in L-TERT-LECs than in L-W. PAX6 (at-RA p<0.0001, Ret p=0.0006, AGN p=0.0010, UVI p=0.0149) and FABP5 (at-RA p=0.0272, AGN p=0.0056) protein expression was significantly higher in L-TERT than in L-W. Both cell lines responded only very slightly to any kind of treatment . There was a significantly altered PAX6 gene expression in L-TERT after treatment with retinoids (up-regulation, at-RA p=0.0005, Ret p=0.0012) and retinoid receptor antagonists (down-regulation, AGN p=0.0124, UVI p=0.0305). There was a significant treatment effect on both L-TERT and L-W regarding FABP5 (L-TERT: up-regulation, at-RA p=0.0451, L-W: down-regulation, UVI p=0.0417, L-TERT and L-W: down-regulation, AGN p=0.0498 (L-TERT) and p<0.0265 (L-W)) and PPARG (L-TERT: up-regulation, at-RA p=0.0057, Ret p=0.0388 and AGN p=0.0251, L-W: down-regulation, UVI p=0.0429) gene expression. In L-W, KRT19 expression was significantly altered upon treatment with retinoids (up-regulation, p<0.0488) and RAR/RXR antagonists (down-regluation, p<0.0428). Sporadically, ADH7 gene expression (L-W: up-regulation, UVI p=0.0229), DSG1 (L-TERT: up-regulation, AGN p=0.0189) and ELOVL7 (L-TERT: up-regulation, AGN p=0.0022) were also altered. No treatment showed an effect on SPINK7 (p>0.1243), KRT3 (p>0.2173) or MKI67 (p>0.1342) gene expression. At protein level, we observed a significant treatment effect on PAX6 protein expression (at-RA: down-regulation in L-TERT p=0.0018 and L-W p=0.0055, AGN: down-regulation in L-TERT p=0.0010), while FABP5 protein expression did not change (p>0.1677). There was a cell line specific treatment effect on DSG1 (AGN p=0.0055) and PPARG (at-RA p=0.0479 and AGN p=0.0108) gene expression and on PAX6 (AGN p=0.0285) protein expression. Conclusion The L-TERT and L-W cell lines are not suitable alternative models to primary LECs and Aniridia-LECs to investigate and compare the effect of retinol metabolism on healthy and PAX6+/--LECs. L-TERT and L-W cell lines are both too similar to eachother in their gene expression, maybe due to a relatively low PAX6 expression in both cell lines. PAX6 expression in L-TERT is higher than in L-W, however, it is only about a quarter of PAX6 expression in human primary LECs.
Link zu diesem Datensatz: urn:nbn:de:bsz:291--ds-414776
hdl:20.500.11880/37241
http://dx.doi.org/10.22028/D291-41477
Erstgutachter: Szentmáry, Nóra
Tag der mündlichen Prüfung: 30-Okt-2023
Datum des Eintrags: 5-Feb-2024
Fakultät: M - Medizinische Fakultät
Fachrichtung: M - Augenheilkunde
Professur: M - Prof. Dr. med. Nóra Szentmáry
Sammlung:SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes

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