Integration eines epigenetischen Nachweises in eine mikrofluidische Plattform

Abstract

Bei der DNA-Methylierung handelt es sich um die am besten beschriebene epigenetische Markierung in Säugetieren. Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster sind mit einer Vielzahl von Krankheiten, wie z. B. Krebs assoziiert. Eine frühe Diagnose ist für den Behandlungserfolg sowie die Überlebenschancen entscheidend. Minimalinvasive Testverfahren sind ein vielversprechender Ansatz um die Akzeptanz der angebotenen Vorsorgeprogramme zu erhöhen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Analyse der DNAMethylierung benötigten Verfahren in die mikrofluidische Lab-on-Chip (LoC) Plattform (Vivalytic) integriert, um eine automatisierte Analyse von DNA-Methylierungsmarkern zu ermöglichen. Die Bisulfitkonvertierung in der Reaktionskammer der Vivalytic Kartusche lieferte mit einer im Rahmen dieser Arbeit etablierten NGS-basierten Qualitätskontrollmethode Konvertierungseffizienzen unmethylierter Cytosine von 97,3 % ± 1,4 %. Zudem wurde eine neue Aufreinigungsmethode unter Verwendung silikabeschichteter magnetischer Partikel sowie eines polymerbasierten Waschpuffers (Bosch) entwickelt. Mit dieser Methode konnten bisDNA-Ausbeuten von 63,0 % ± 10,9 % in der Vivalytic Kartusche erzielt werden. Lyophilisierte Mastermix Beads konnten identifiziert werden, mit welchen der Nachweis des SEPT9 Methylierungsmarkers sowie die Desulfonierungsreaktion während der initialen Denaturierungsphase der qPCR (10 min, 95 °C) möglich war. Die blockerbasierte HeavyMethyl-qPCR (HM-qPCR) wurde durch die Identifizierung eines geeigneten Thermoprogramms, mit Hilfe eines simulationsbasierten Ansatzes erfolgreich in die Vivayltic Kartusche integriert. Im Rahmen dieses proof-of-principle konnte die Machbarkeit der Analyse von DNA-Methylierungsmarkern mit der Vivayltic Plattform gezeigt werden, womit ein wichtiger Schritt für die Anwendung epigenetischer Tests in der Point-of-Care (PoC) Diagnostik mit Hilfe von LoC-Systemen geleistet wurde.

Aberrations in DNA-methylation patterns are associated with many diseases, e. g. cancer. An early diagnosis is critical for treatment succes and survival chances of cancer patients. Minimally invasive tests are a promising approach to increase the acceptance of cancer pre-screening programs. Within this work the complex opperations needed for DNA-methylation analysis have been integrated into the microfluidic Lab-on-Chip (LoC) platform (Vivalytic) to enable an automated analysis of DNA-methylation markers. The bisulfite conversion within the reaction chamber of the Vivalytic cartridge resulted in conversion efficiencies of unmethylated cytosines around 97,3 % ± 1,4 % applying a developed NGS-based quality control method. Additionally a purification method, using silica-covered magnetic particles and a polymer-based wash buffer (Bosch) was developped. With this method DNA yields of up to 63,0 % ± 10,9 % were achieved in the Vivalytic cartridge. Lyophilized mastermix beads could be identified suitable for the detection of the SEPT9 methylation marker as well as the performance of the desulfonation reaction within the initial denaturation phase (10 min, 95 °C) of the qPCR reaction. The blockerbased HeavyMethyl (HM) qPCR was succuessfully integrated into the Vivalytic cartridge using a simulation-based approach for identification of a suitable temperature program. Within this proof-of-principle the feasibility of DNA-methylation analysis with the Vivalytic platform could be demonstrated, which was an important step for the application of epigenetic testing in point-of-care (PoC) diagnostics within LoC-systems.