Structure-and activity-guided biotechnological engineering to produce improved anti-Gram-negative darobactins

Abstract

The darobactins are a recently discovered class of antibiotic candidates showing antibacterial activity against Gram-negative pathogens. This thesis showcases the establishment of a versatile heterologous expression platform to overproduce these ribosomally produced and post-translationally modified peptides (RiPPs) to investigate this pharmaceutically promising compound class and to make darobactins available for further development. The biotechnological approach enabled the functional characterization of the biosynthetic gene cluster and the generation of novel analogues. Derivatives were profiled and Darobactin 9 (D9) was highlighted, a molecule with up to 8-fold enhanced antibacterial activity against hard-to-treat pathogens compared to its native counterpart. Optimization of D9 using a structure–activity relationship (SAR) approach by structural elucidation of the molecule’s binding mode with the target protein inspired a second series of analogues, with derivative D22 surpassing the activity of D9. The generated SAR data facilitated a third derivatisation series, where modelled modifications at hitherto underexplored positions were applied, enabling comprehensive understanding of the influence of different substitutions at positions 2, 4, 5, 6 and 7 of the heptapeptide for bioactivity. Moreover, diverse models were utilized to profile darobactins, paving the way for in vivo studies. This thesis can serve as a blueprint for future efforts in RiPPs antibiotic development.

Die Antibiotikaklasse der Darobactine zeichnet sich durch antibakterielle Aktivität gegen ein breites Spektrum Gram-negativer Pathogene aus. Diese Doktorarbeit beschäftigt sich mit der Etablierung einer heterologen Expressionsplattform, um ribosomal produzierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) dieser neuen Substanzklasse zu studieren und einer Weiterentwicklung zuzuführen. Das biosynthetische Darobactin-Gencluster wurde funktionell charakterisiert und natürliche sowie artifizielle Darobactinderivate produziert. Dabei fiel ein neuartiges Darobactin (D9) auf, das im Vergleich zum nativen Darobactin A (DA) eine bis zu 8-fach erhöhte antibakterielle Aktivität gegen kritisch eingestufte Pathogene aufweist. Zur Optimierung von D9 wurde ein struktur– und aktivitätsgeleiteter Ansatz verfolgt, um verbesserte Derivate zu erzeugen. Von diesen ist D22 hervorzuheben, das D9 in seiner antibakteriellen Aktivität übertrifft. Basierend auf Strukturdaten des BamABCDE (BAM)-D9- und BAM-D22-Komplexes wurden weitere Modifikationen des Darobactin-Grundgerüsts modelliert und experimentell untersucht. Anhand der struktur- und aktivitätsgeleiteten Modifikationen des Darobactin-Heptapeptids an Position 2, 4, 5, 6 und 7 wurden anschließend die Auswirkungen auf die Bioaktivität charakterisiert. Somit stellt diese Arbeit auch eine Fallstudie für die Entwicklung von RiPPs hin zu neuen Antibiotika dar.