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doi:10.22028/D291-41915
Title: | Maturation of activity-dependent endocytosis in inner hair cells of the mouse cochlea |
Author(s): | Huang, Guobin |
Language: | English |
Year of Publication: | 2023 |
Place of publication: | Homburg/Saar |
DDC notations: | 570 Life sciences, biology 610 Medicine and health |
Publikation type: | Dissertation |
Abstract: | The organ of Corti contains inner hair cells (IHCs), named for their hair-shaped structures
called stereocilia, as the primary sensory cells of the auditory system. IHCs transmit acoustic
information to the auditory pathway by constantly releasing synaptic vesicles without
exhaustion. For stable sound encoding, it is crucial that the active zone is cleared by retrieval
of the vesicle membrane via endocytosis and that the synaptic vesicle pool is efficiently
replenished. Before the onset of hearing (at postnatal day 12 in mice), IHCs and their synaptic
release machinery undergo terminal differentiation, which involves the up- and downregulation
of several proteins and fundamental changes in their physiology. Whether endocytosis
experiences a similar maturation process is so far poorly understood. Here, I aimed to
investigate potential developmental changes in the molecular composition and kinetics of the
endocytic machinery of IHCs.
Using quantitative fluorescence in situ hybridization, I compared the transcription profiles of
three endocytic proteins – dynamin1, dynamin-3, and endophilin-A1 – in pre-mature and
mature mouse organs of Corti. The results revealed that IHCs expressed low levels of dnm1
(encoding dynamin-1), dnm3 (encoding dynamin-3) and sh3gl2 (encoding endophilin-A1)
mRNA transcripts. After the onset of hearing, dnm1 transcription was upregulated.
Immunolabeling corroborated robust expression of dynamin-1 and another endocytic protein,
adapter protein 180, in the soma of mature IHCs, while both were weakly expressed before
the onset of hearing. Dynamin-3 was largely absent from IHCs but was abundant on mRNA
and protein levels in outer hair cells, the sound amplifiers of the auditory system with low
synaptic activity. It was localized in the soma and at the periphery of the cuticular plates of
both pre-mature and mature outer hair cells, suggesting an activity-independent function, such
as for recycling of proteins from the stereocilia.
Through whole-cell patch clamp recordings at near-physiological temperature, I furthermore
evaluated activity-dependent exocytosis and endocytosis in IHCs before and after the onset of
hearing by analyzing the change in their membrane capacitance. Following depolarizationinduced
exocytosis, the decline in membrane capacitance – indicating endocytosis – was
faster in mature IHCs compared to pre-mature IHCs. Moderate repetitive stimulation was used
to elicit sustained release of the readily releasable pool of synaptic vesicles. In mature IHCs,
it caused an initially steep rise in membrane capacitance that subsequently slowed down to a
linear course, suggesting the intervention of efficient endocytosis, which contrasts the
saturating increase in pre-mature IHCs that might indicate the onset of pool depletion upon
repetitive moderate stimulation. Similarly, following excessive repetitive stimulation that
presumably challenged the secondary releasable pool, membrane capacitance increased less
12
in mature than pre-mature IHCs. These data suggest that increased endocytosis in mature
IHCs efficiently compensates for exocytosis, which might result in faster replenishment of the
vesicle pools than in pre-mature IHCs. In addition, the temperature-sensitivity of endocytosis
was increased in mature IHCs as revealed by recordings at ambient temperature, further
supporting that the endocytic machinery changes during terminal differentiation. When
blocking dynamin activity, endocytosis was largely unaffected in pre-mature IHCs, whereas it
was significantly hampered in mature IHCs. This implies that dynamin, presumably dynamin-1
due to its developmentally increased expression, is more important in endocytosis of IHCs
after terminal differentiation.
In summary, this thesis reveals i) developmentally regulated expression of endocytic proteins
in hair cells and ii) enhanced endocytosis in mature IHCs, both supporting that the endocytic
machinery of IHCs indeed undergoes terminal differentiation. Moreover, in pre-mature IHCs
the low expression of dynamin-1 and insensitivity to dynamin inhibition suggests a pivotal role
of a so far unknown process of dynamin-independent endocytosis, whereas endocytosis of
mature IHCs might be reinforced by mechanisms requiring dynamin-1 along with adapter
protein 180. Das Corti-Organ enthält als primäre Sinneszellen des Hörsystems die inneren Haarsinneszellen (IHZ), die nach ihren haarförmigen Strukturen, den sogenannten Stereozilien, benannt sind. Die IHZ übermitteln akustische Informationen an die Hörbahn, indem sie unermüdlich synaptische Vesikel freisetzen. Für eine zuverlässige Schallkodierung ist von entscheidender Bedeutung, dass die Vesikelmembran mittels Endozytose von den aktiven Zonen entfernt und der synaptische Vesikelpool effizient wiederaufgefüllt wird. Vor Hörbeginn (am postnatalen Tag 12 in Mäusen) durchlaufen die IHZ und ihre Synapsen eine Phase terminaler Differenzierung, welche die Hoch- und Herunterregulierung mehrerer Proteine, sowie umfassende physiologische Veränderungen beinhaltet. Bisher ist weitgehend unbekannt, ob die Endozytose einen ähnlichen Reifungsprozess durchläuft. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, die molekulare Zusammensetzung und Kinetik der endozytischen Maschinerie auf mögliche Veränderungen während der Reifung der IHZ zu untersuchen. Mittels quantitativer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung verglich ich die Transkriptionsprofile von drei endozytischen Proteinen – Dynamin-1, Dynamin-3 und Endophilin-A1 – vor und nach Hörbeginn in Corti-Organen von Mäusen. Die Ergebnisse zeigten, dass unreife IHZ nur geringe mRNA-Kopien von dnm1 (kodiert Dynamin-1), dnm3 (kodiert Dynamin-3) und sh3gl2 (kodiert Endophilin-A1) enthielten. Nach Hörbeginn war die Transkription von dnm1 hochreguliert. Immunhistochemische Färbungen bestätigten die robuste Expression von Dynamin-1 und Adapterprotein-180, einem weiteren endozytischen Protein, im Soma reifer IHZ, während beide Proteine vor der Reifung nur schwach exprimiert waren. Dynamin-3 war in den IHZ kaum vorhanden, jedoch in äußeren Haarzellen, den Schallverstärkern des auditorischen Systems mit geringer eigener synaptischer Aktivität, auf mRNA- sowie Proteinebene stark exprimiert. Dynamin-3 war im Soma und am Rand der Kutikularplatten sowohl unreifer als auch reifer äußerer Haarzelle lokalisiert, und könnte dort eine aktivitätsunabhängige Funktion erfüllen, z.B. beim Recycling von Proteinen aus den Stereozilien. Mit Hilfe von Patch-Clamp-Ableitungen bei annähernd physiologischer Temperatur untersuchte ich die Exozytose und Endozytose in Abhängigkeit des Reifegrades, indem ich die aktivitätsabhängige Änderung der Membrankapazität der IHZ vor und nach Hörbeginn analysierte. Nach depolarisierungsabhängiger Exozytose war die Abnahme der Membrankapazität, ein Maß für Endozytose, in reifen IHZ schneller als in unreifen. Moderate repetitive Stimulation wurde verwendet, um eine anhaltende Vesikelausschüttung aus dem schnell freisetzbaren Vesikelpool auszulösen. Diese Stimulation verursachte in reifen IHZ einen anfänglich steilen Anstieg der Membrankapazität, der sich zu einem linearen Verlauf |
Link to this record: | urn:nbn:de:bsz:291--ds-419156 hdl:20.500.11880/37497 http://dx.doi.org/10.22028/D291-41915 |
Advisor: | Engel, Jutta |
Date of oral examination: | 16-Apr-2024 |
Date of registration: | 19-Apr-2024 |
Faculty: | M - Medizinische Fakultät |
Department: | M - Biophysik |
Professorship: | M - Prof. Dr. Jutta Engel |
Collections: | SciDok - Der Wissenschaftsserver der Universität des Saarlandes |
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Thesis_Guobin_Huang_2.pdf | Doktorarbeit von Guobin Huang ohne CV | 15,52 MB | Adobe PDF | View/Open |
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