Response of immune killer cells to mechanical cues and living therapeutic materials

Abstract

NK cells are one of the major immune killer cell types exhibiting anti-tumor activity. During immune surveillance NK cells infiltrate into tissues and come in contact with cells and organs with varied stiffness. It has been shown that tumor cells with a lower elasticity modulus than their counterparts to have a higher metastatic potential. Whether the change in tumor cell stiffness affects the functionality of NK cells is not well understood. In this work, to test the effect of substrate stiffness on NK responses, PAAm-co-AA hydrogels of varied stiffness (2 kPa,12 kPa, 50 kPa) functionalized with biotinylated NKp46 activating antibody, prepared by Dr. Jingnan Zhang (research group of Prof. del Campo, INM-Leibniz Institute for New Materials) were used. Stiffness of substrate indeed played a huge role in modulating NK responses with stiffer substrates (12 kPa, 50 kPa) eliciting a stronger response in most donors whereas the soft substrates (2 kPa) failed to do so. To further test the impact of target cell stiffness on NK cytolytic activity, stiffness of target cells was altered using blebbistatin (made cells stiffer) and DMSO (made cells softer). Cytotoxicity of NK cells was boosted against stiffened tumor cells and impaired against softened tumor cells. In addition, the time required for NK cell to detach from the stiffened target cell after apoptosis or necrosis of the latter was significantly shorter, also contributing to a more effective cytotoxicity. To further decipher the role of mechanosensing in killing processes, functions of mechanosensitive ion channels was blocked using unspecific antagonizers (gadolinium and nifedipine), and it was found that blockage of mechanosensing substantially impaired NK mediated cytotoxicity as determined by 2D and 3D killing assays. Regarding the responsible mechanosensor, we have identified from the microarray data of our lab (by Dr. Eva Schwarz) that PIEZO1 are the predominately expressed mechanosensitive ion channels in NK cells. Blockade of PIEZO1 in NK cells by GsMTx4 impaired NK mediated cytotoxicity and activation of PIEZO1, using its specific agonist Yoda-1, potentiated NK mediated killing of the target cells. Blockade of PIEZO1 was shown to decrease the infiltration of NK cells into 3D collagen matrices, and activation of PIEZO1 boosted the infiltration of NK cells into 3D collagen matrix. As the role of PIEZO1 to be a major mechanosensor in NK cells was established, its role in sensing the stiffness of substrates was explored. Perturbation of PIEZO1 channels abrogated NK responses to substrate stiffness. Together, these data emphasize the role of mechanosensing in regulating NK cytotoxicity and the central role of tumor cell stiffness in evading immune surveillance. To fight cancer and other infective diseases, living therapeutic materials (LTMs) offer possibilities to release therapeutics in a sustainable and tunable manner. LTMs contain genetically engineered biological component encapsulated in a polymeric material such as hydrogels to contain their exposure in the host. LTMs are being extensively researched for their use in treatment of cancer with many studies reinforcing the beneficial effects of using smart materials. To contain the exposure of living component such as bacteria and to protect it from adverse environmental conditions of the host and to avoid a direct contact with immune cells, they are often encapsulated. However, one major concern for LTMs is that they may trigger an immune response and create a pro-inflammatory milieu in the host which could lead to critical situations if unregulated. So, the second part of my thesis is to characterize the immune response of PBMCs to PluDA hydrogel encapsulated E.coli and ClearColi bacteria. This work was carried out in collaboration with the group of Dr. Shrikrishnan Sankaran, Bioprogramable materials, INM-Leibniz Institute for New Materials, Saarbrücken. The ClearColi strain was produced from E.coli after genetically deleting LPS. ClearColi was encapsulated in Pluronic F127-based hydrogels (PluDA). It has to be noted that the bacteria were not in direct contact with the host so any immune reaction elicited would be due to the release of soluble factors and metabolites. The release of pro-inflammatory cytokines (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNFα and IFNγ) and cytotoxic proteins (granzyme A, granzyme B, perforin, granulysin, sFas, and sFasL) by PBMCs in response to bacteria and bacteria encapsulated gels was checked along with its influence on immune killer cells’ subtypes. Interestingly, PBMCs from the blood donors could be grouped in to two groups, donors with low spontaneous IL-2 and high spontaneous IL-2 release, based on the IL-2 release when PBMCs were cultured alone. Our results show that co-incubation of PluDA blank gels with PBMCs did not alter their profiles of cytokines and cytotoxic proteins, and had no influence on differentiation of NK cells, CD4+ and CD8+ T cells in donors with low spontaneous release of IL-2. ClearColi elicited release of IL-6 and IFNγ from PBMCs. Interestingly, the predominantly released cytokine was IL-6 for low spontaneous IL-2 release donors, but IFNγ for high spontaneous IL-2 release donors. Both the transwell condition and the encapsulated gel condition showed the same tendency. When the bacteria were in direct contact with the PBMCs they triggered the apoptosis of PBMCs on day 3 but encapsulation of the bacteria in PluDA gels completely abolished this effect.

NK-Zellen sind eine der wichtigsten Arten von Killerzellen des Immunsystems im Kampf gegen Krebs. . Während der Immunüberwachung infiltrieren NK-Zellen ins Gewebe und kommen mit Zellen und Organen unterschiedlicher Steifigkeit in Kontakt. Es hat sich gezeigt, dass Tumorzellen mit einem niedrigeren Elastizitätsmodul ein höheres Metastasierungspotenzial haben als solche mit einem höheren Elastizitätsmodul. Ob sich die veränderte Steifigkeit der Tumorzellen auf die Funktionalität der NK-Zellen auswirkt, ist noch nicht ausreichend geklärt. In dieser Arbeit wurden PAAm-co-AA-Hydrogele unterschiedlicher Steifigkeit (2 kPa, 12 kPa, 50 kPa), die mit einem biotinylierten, NKp46 aktivierenden Antikörper funktionalisiert waren, von Dr. Jingnan Zhang (Forschungsgruppe von Prof. del Campo, INM-Leibniz-Institut für Neue Materialien) verwendet, um die Auswirkungen der Substratsteifigkeit auf NK-Zellfunktionen zu untersuchen. Die Steifigkeit des Substrats spielte in der Tat eine große Rolle bei der Modulation der NKFunktionalität, wobei steifere Substrate (12 kPa, 50 kPa) bei den meisten Spendern eine stärkere Reaktion auslösten, während dies bei den weichen Substraten (2 kPa) nicht der Fall war. Um die Auswirkungen der Steifigkeit der Zielzellen auf die zytotoxische Aktivität der NK-Zellen weiter zu testen, wurde die Steifigkeit der Zielzellen mit Hilfe von Blebbistatin (machte die Zellen steifer) und DMSO (machte die Zellen weicher) verändert. Die Zytotoxizität der NK-Zellen gegen steifere Tumorzellen war stärker als gegen weichere Tumorzellen. Darüber hinaus war die Zeit, die die NK-Zellen benötigten, um sich nach der Apoptose oder Nekrose einer steiferen Krebszelle von dieser zu lösen, deutlich kürzer als bei einer weicheren Krebszelle, was ebenfalls zu einer effektiveren Zytotoxizität beitrug. Um die Rolle der Mechanosensorik im Tötungsprozess weiter zu entschlüsseln, wurden die Funktionen mechanosensitiver Ionenkanäle mit Hilfe unspezifischer Antagonisten (Gadolinium und Nifedipin) blockiert. Es zeigte sich, dass die Blockierung der Mechanosensorik die durch NK-Zellen vermittelte Zytotoxizität erheblich beeinträchtigte, wie durch 2D- und 3D-Zytotoxizitätsassays ermittelt wurde. Was den verantwortlichen Mechanosensor betrifft, so haben wir anhand bereits vorhandener Microarray-Daten (von Dr. Eva Schwarz) unseres Labors festgestellt, dass PIEZO1 Kanäle die vorwiegend exprimierten mechanosensitiven Ionenkanäle in NK-Zellen sind. Die Blockade von PIEZO1 in NK-Zellen durch GsMTx4 beeinträchtigte die NK-vermittelte Zytotoxizität, und die Aktivierung von PIEZO1 durch seinen spezifischen Agonisten Yoda-1 verstärkte die NK-vermittelte Abtötung der Zielzellen. Die Blockade von PIEZO1 verringerte die Infiltration von NK-Zellen in 3D-Kollagenmatrizen, während die Aktivierung von PIEZO1 die Infiltration von NK-Zellen in die 3D-Kollagenmatrix verstärkte. Da die Rolle von PIEZO1 als wichtiger Mechanosensor in NK-Zellen somit nachgewiesen wurde, wurde seine Rolle bezüglich der Steifigkeit von Substraten untersucht. Eine Inhibierung der PIEZO1-Kanäle verminderte die Reaktionen der NK auf die Steifigkeit des Substrats. Zusammengenommen unterstreichen diese Daten die Rolle der Mechanosensorik bei der Regulierung der NK-Zytotoxizität und die zentrale Rolle der Steifigkeit von Tumorzellen bei der Umgehung der Immunüberwachung. Zur Bekämpfung von Krebs und anderen Infektionskrankheiten bieten lebende therapeutische Materialien (LTM) die Möglichkeit, Therapeutika auf nachhaltige und abstimmbare Weise freizusetzen. LTMs enthalten gentechnisch veränderte biologische Komponenten, die in einem Polymermaterial wie Hydrogelen eingekapselt sind, um ihre Exposition im Wirt zu begrenzen. LTMs werden derzeit intensiv für ihren Einsatz in der Krebsbehandlung erforscht, wobei viele Studien die positiven Auswirkungen der Verwendung intelligenter Materialien unterstreichen. Um die Exposition von lebenden Komponenten wie Bakterien einzudämmen, sie vor ungünstigen Milieubedingungen im Wirt zu schützen und einen direkten Kontakt mit Immunzellen zu vermeiden, werden sie häufig eingekapselt. Eine große Sorge bei LTMs ist jedoch, dass sie eine Immunreaktion auslösen und ein entzündungsförderndes Milieu im Wirt schaffen können, das zu kritischen Situationen führen könnte, wenn es nicht reguliert wird. Der zweite Teil meiner Dissertation besteht darin, die Immunantwort von PBMCs auf in PluDA-Hydrogel eingekapselte E.coli und ClearColi Bakterien zu charakterisieren. Diese Arbeit wurde in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Dr. Shrikrishnan Sankaran (Bio-programmierbare Materialien, INM-Leibniz- Institut für Neue Materialien, Saarbrücken) durchgeführt. Der ClearColi-Stamm wurde aus E.coli nach genetischer Deletion von LPS hergestellt. ClearColi wurde in Hydrogelen auf der Basis von Pluronic F127 (PluDA) eingekapselt. Somit war gewährleistet, dass die Bakterien nicht in direktem Kontakt mit dem Wirt standen, so dass jede ausgelöste Immunreaktion auf die Freisetzung von löslichen Faktoren und Metaboliten zurückzuführen ist. Die Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNFα und IFNγ) und zytotoxischen Proteinen (Granzym A, Granzym B, Perforin, Granulysin, sFas und sFasL) durch PBMCs als Reaktion auf Bakterien und bakterienverkapselte Gele wurde zusammen mit ihrem Einfluss auf die Subtypen der Immunkillerzellen untersucht. Unerwarteterweise konnten die PBMCs der Blutspender in zwei Gruppen eingeteilt werden: Spender mit geringer spontaner IL-2- Freisetzung und Spender mit hoher spontaner IL-2-Freisetzung, basierend auf der IL-2-Freisetzung von PBMCs ohne Stimulus. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Co-Inkubation von PluDA-Gelen mit PBMCs deren Profile von Zytokinen und zytotoxischen Proteinen nicht veränderte und keinen Einfluss auf die Differenzierung von NK-Zellen, CD4+ und CD8+ T-Zellen bei Spendern mit geringer spontaner IL-2-Freisetzung hatte. ClearColi löste die Freisetzung von IL-6 und IFNγ aus PBMCs aus. Interessanterweise war das vorwiegend freigesetzte Zytokin IL-6 bei Spendern mit geringer spontaner IL-2-Freisetzung, aber IFNγ bei Spendern mit hoher spontaner IL-2- Freisetzung. Sowohl bei der Transwell-Bedingung als auch bei der verkapselten Gel-Bedingung zeigte sich die gleiche Tendenz. Wenn die Bakterien in direktem Kontakt mit den PBMCs waren, lösten sie am dritten Tag die Apoptose der PBMCs aus, die Verkapselung der Bakterien in PluDAGelen hob diesen Effekt jedoch vollständig auf.