Extraneuronale Lokalisation und subzelluläre Analyse von Latrophilin 2 in Niere und Leber in genetisch veränderten Reportermäusen.

Abstract

Die Superfamilie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren (G protein-coupled receptors; GPCR) ist eine der größten und am besten untersuchten Proteinfamilien. Ihre Mitglieder reagieren auf ein umfangreiches Panel verschiedener Liganden und beteiligen sich an außerordentlich vielen physiologischen Funktionen. Sie sind biologische Rezeptoren in der Zellmembran, die Signale über Guanosintriphosphat bindende Proteine (kurz G Proteine) in das Zellinnere im Sinne einer Signaltransduktion weiterleiten. Sie sind essenziell für die intra- und interzelluläre Kommunikation und somit fundamental für die Funktion eines Organismus mitverantwortlich. Während dieser Bereich der Forschung rasant zunimmt, wächst auch das Interesse an speziellen Unterfamilien wie den Adhäsions G protein-gekoppelter Rezeptoren (aGPCRs), da solche sich ebenfalls an verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Ereignissen beteiligen, welche für die menschliche Gesundheit relevant sein könnten. Von Säugetieren werden solche Rezeptoren, die Latrophiline, z.B. im Zentralnervensystem, Nieren, Leber und Herz exprimiert (Boucard et al., 2014). In einer Pilotarbeit von Simon Zaffalon (Doktorand AG Prof. Dr. Krasteva-Christ) wurden die Latrophiline auf mehreren Ebenen der Molekülexpression untersucht. Hier zeigte sich in einem initialen Screening verschiedener Mausgewebe eine vermehrte Expression von Latrophilin 2 vor allem in Niere, Leber und Zunge. Aufbauend auf dieser Erkenntnis soll nun im Folgenden mit Hilfe klassischer Proteinanalytik, Immunhistochemie und Fluoreszenzmikroskopie der Latrophilin2 Rezeptor und seine Expression weiter untersucht werden. Im Hinblick auf die extraneuronale Relevanz und die genaue Identifizierung auf zellulärer und subzellulärer Ebene sollten genannte Verfahren etabliert und verbessert werden, um sie für die Weitererforschung effizient nutzen zu können. In Nieren- und Lebergewebe einer speziellen Reportermaus konnte das Lphn2-mVenus Fusionsprotein auf allen Ebenen der Proteinanalytik nachvollzogen werden, wobei die Ergebnisse mit den Vorarbeiten weitegehend übereinstimmen. Aufgrund geringer Expression des Fusionsproteins und der Untersuchung in Geweben mit sehr hoher Autofluoreszenz, mussten Verfahren entwickelt werden, um das Signal zu verstärken oder die Autofloureszenz zu reduzieren. Es gelang, Verfahren zur Verbesserung der Sichtbarmachung relevanter Aspekte in der Histologie zu entwicklen, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis verbessert, sowie zeitliche und methodische Limitationen im Umgang mit den Materialien herausgestellt wurden. Die subzelluläre Analyse zeigt das Vorhandensein des Signals an dem Lumen zugewandter Grenzflächen/Membranen im Tubulussystem der Niere als auch entlang der Gallenkanälchen der Leber. Mehrere Funktionsmuster des Rezeptors sind aufgrund dieser Verteilung denkbar und wurden in der Zusammenschau mit bestehenden Arbeiten diskutiert, sowie weitere Forschungsansätze angeregt.

Summary The G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily is one of the largest and best-studied protein families. Its members respond to an extensive panel of different ligands and participate in an extraordinary range of physiological functions. They are biological receptors in the cell membrane that transmit signals via guanosine triphosphate binding proteins (G proteins for short) into the cell interior in the sense of signal transduction. They are essential for intra- and intercellular communication and are therefore fundamentally responsible for the function of an organism. While this area of research is expanding rapidly, interest is also growing in specific subfamilies such as the adhesion G protein-coupled receptors (aGPCRs), as they also participate in various physiological and pathophysiological events that may be relevant to human health. In mammals, such receptors, the latrophilins, are expressed, for example, in the central nervous system, kidneys, liver and heart (Boucard et al., 2014). In a pilot work by Simon Zaffalon (PhD student AG Prof. Dr. Krasteva-Christ), the latrophilins were examined at several levels of molecular expression. An initial screening of various mouse tissues showed increased expression of latrophilin 2, especially in the kidney, liver and tongue. Building on this knowledge, the latrophilin2 receptor and its expression will now be further investigated using classical protein analysis, immunohistochemistry and fluorescence microscopy. With regard to the extraneuronal relevance and precise identification at the cellular and subcellular level, the methods mentioned should be established and improved in order to be able to use them efficiently for further research. In the kidney and liver tissue of a special reporter mouse, the Lphn2-mVenus fusion protein could be traced at all levels of protein analysis, with the results largely in agreement with the previous work. Due to low expression of the fusion protein and the study in tissues with very high autofluorescence, methods had to be developed to enhance the signal or reduce autofluorescence. It was possible to develop procedures to improve the visualization of relevant aspects in histology, which improved the signal-to-noise ratio and highlighted time and methodological limitations in handling the materials. Subcellular analysis shows the presence of the signal at lumen-facing interfaces/membranes in the tubular system of the kidney as well as along the bile canaliculi of the liver. Several functional patterns of the receptor are conceivable based on this distribution and were discussed in conjunction with existing work and further research approaches were suggested