Calcium-Abhängigkeit von TRPV6-Varianten

Abstract

Calcium-Abhängigkeit von TRPV6-Varianten Das “transient receptor potential“ Protein TRPV6 bildet in der Plasmamembran calciumselektive Ionenkanäle, welche durch intrazelluläre Calciumionen inhibiert werden. TRPV6-Proteine besitzen eine C-terminale Calcium/Calmodulin-Bindestelle, welche an der Calcium-abhängigen Inhibition beteiligt ist. Die Calcium/Calmodulin-Bindestelle beinhaltet zudem eine Sequenz, welche mit einer Protein Kinase C bedingten Phosphorylierungsstelle übereinstimmt. Aufgrund der Tatsache, dass der Ionenkanal TRPV6 in einer Vielzahl von verschiedenen Tumorgeweben nachgewiesen wurde, nimmt sowohl die Charakterisierung, als auch die Modulation und Hemmung dieses Ionenkanals, eine wichtige Stellung in Bezug auf eine mögliche Tumortherapie ein. In dieser Arbeit wurden die initial publizierte humane Variante von TRPV6 (hTRPV6short) (725 Aminosäuren) (Wissenbach et al., 2001), die später entdeckte, von einem nicht-AUG-Codon-startende, längere Variante (hTRPV6long) (765 Aminosäuren) (Fecher-Trost et al., 2013) und der TRPV6-Kanal der großen Bartfledermaus „Myotis brandtii“ (TRPV6Myotis) (763 Aminosäuren) in „Human Embryonic Kidney“ (HEK293) Zellen exprimiert. Zu Beginn erfolgte die Etablierung des Floureszenz-Spektrophotometers. Hierbei wurden mithilfe von Testexperimenten sowohl die optimalen Programmeinstellungen und Umgebungsfaktoren für die Messungen, als auch die Handhabung und Fura-2-Beladung der Zellen, ermittelt. Anschließend erfolgte die Messung der Calcium-Abhängigkeit der einzelnen Varianten mittels des Fluoreszenzfarbstoffes Fura-2-AM. Neben der Verwendung von HEK Zellen, die stabil die TRPV6-Varianten hTRPV6long, hTRPV6short und TRPV6Myotis exprimierten, fand auch eine transiente Expression von hTRPV6long in HEK Zellen statt. Zuletzt genannte Methode führte bei der gleichzeitigen Messung der Zellpopulation im Fluoreszenz-Spektrophotometer zu kaum einen Unterschied zwischen hTRPV6long und der Kontrolle, weshalb die stabil TRPV6-exprimierenden Zelllinien im weiteren Verlauf verwendet wurden. Es konnte festgestellt werden, dass die beiden humanen Varianten von TRPV6 sowohl in der extrazellulären Calcium-Abhängigkeit, als auch in der Kinetik der intrazellulären Calcium-Signale identisch sind. Während die extrazelluläre Calcium-Abhängigkeit der intrazellulären Calcium-Signale zwischen humanem und myotis TRPV6 keine Unterschiede aufweist, ist die Kinetik des intrazellulären Calcium-Anstieges und -Abfalls bei TRPV6Myotis signifikant langsamer. Für die Modulierung von TRPV6 mittels Calmodulin-Inhibitoren wurden die Substanzen Calmidazolium, Ophiobolin A und Trifluoperazin verwendet. Einzig bei Trifluoperazin wurde eine dosis-abhängige (mittlere inhibitorische Konzentration = 30-50 µM) Inhibition der intrazellulären Calcium-Signale in HEK Zellen mit jeweils humanem oder myotis TRPV6 festgestellt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass über die Modulation der Protein Kinase C eine Inhibition des TRPV6-abhängigen Calcium-Signals stattfindet. Hierbei inhibiert die Substanz Chelerythrin, welche als Protein Kinase C Inhibitor gehandhabt wird, das intrazelluläre Calcium-Signal, in HEK293 Zellen mit jeweils humanem oder myotis TRPV6, dosis-abhängig (mittlere inhibitorische Konzentration = 2-5 µM). Währenddessen konnten der Protein Kinase C Inhibitor Gö 6983 und der Protein Kinase C Aktivator Phorbol-12-mystrat-13-acetat keinen Effekt auslösen. Zudem wurde der Effekt der Substanz Hexylresorcinol auf die unterschiedlichen Kanal-Varianten untersucht. Dabei wurde keine Modulierung des intrazellulären Calcium-Signals festgestellt, obwohl in meiner Arbeitsgruppe mittels anderer Messverfahren eine Inhibition von TRPV6 bereits beschrieben worden war. Des Weiteren wurde ein Protein aus dem Proteobakterium, welches eine Aminosäuresequenz ähnlich derer mit der Porenregion von hTRPV6long aufweist, in einer stabilen HEK-Zelllinie untersucht. Es konnte jedoch kein verändertes Verhalten in der Ca2+-Aufnahme, im Vergleich zur Kontrolle, detektiert werden.

Calcium-dependence of TRPV6-variants The “transient receptor potential” protein TRPV6 forms calcium selective ion channels in the plasma membrane which are inhibited by intracellular calcium ions. TRPV6 proteins exhibit a C-terminal calcium/calmodulin binding site, suggested to be responsible for the calcium dependent inhibition. This calcium/calmodulin binding site also includes a consensus sequence for a protein kinase C dependent phosphorylation site. Because of the fact that TRPV6 was detected in many different tumor tissues, the characterization as well as the modulation and inhibition of this ion channel takes an important status according to a possible tumor therapy. In this work the initially published human variant of TRPV6 (hTRPV6short) (725 amino acids) (Wissenbach et al., 2001), the later discovered, from a non-AUG-codon starting, longer variant of TRPV6 (hTRPV6long) (765 amino acids) (Fecher-Trost et al., 2013) and the TRPV6 channel of the brandt’s bat „Myotis brandtii“ (TRPV6Myotis) (763 amino acids) were expressed in „Human Embryonic Kidney“ (HEK293) cells. In the beginning the establishment of the fluorescence spectrophotometer took place. Using test experiments, the ideal program settings and environmental factors for the measurements as well as the handling and fura-2 loading of the cells were determined. Next the calcium dependence of the respective variants was measured with the fluorescent dye fura-2-AM. In addition to HEK cells stable expressing the TRPV6-variants hTRPV6long, hTRPV6short and TRPV6Myotis, HEK cells transiently expressing hTRPV6long were used. The latter method demonstrated that the simultanious measurement of the cell populations in the fluorescence spectrophotometer barely showed a difference between hTRPV6long and the control. This is the reason for using the stable TRPV6 expressing cell lines in further experiments. Some of those experiments demonstrated that the comparison of both human TRPV6 variants according to the extracellular calcium dependence and the intracellular calcium kinetic could show no differences. While there was also no difference between the human and myotis TRPV6 when looking at the extracellular calcium dependence of the intracellular calcium signals, the kinetics of the intracellular calcium increase and decrease were significant slower in cells expressing TRPV6Myotis. For the modulation of TRPV6 via calmodulin inhibitors the substances calmidazolium, ophiobolin A and trifluoperazine were used. Only with trifluoperazine a dose-dependent (half-maximal inhibitory concentration = 30-50 µM) inhibition of the intracellular calcium signal in HEK cells expressing human or myotis TRPV6 could be determined. Moreover, the modulation of the protein kinase C showed an inhibition of the TRPV6-dependent calcium signal. According to this the substance chelerythrine, handled as a protein kinase C inhibitor, inhibited the intracellular calcium signal in HEK293 cells with human or myotis TRPV6 in a dose-dependent manner (half-maximal inhibitory concentration = 2-5 µM). In contrast to this result the protein kinase C inhibitor Gö 6983 and the protein kinase C activator phorbol-12-myristate-13-acetate had no effect. In addition to this the effect of the substance hexylresorcinol on the different channel variants was investigated. Although my work group described via different measuring methods an inhibition of TRPV6 through hexylresorcinol, no modulation of the intracellular calcium signal could be shown. Moreover, a protein from the proteo bacterium whose amino acid sequence resembles the pore region of hTRPV6long was investigated in a stable HEK cell line. Compared to a control group no difference in the calcium uptake could be shown.