Die Rolle von TRPC-Kanälen in Astrozyten des Rückenmarks

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von Transient Rezeptor Potential (TRP)-Ionenkanälen in primären Astrozyten aus dem Rückenmark der Maus mit Hilfe von immunzytochemischen Färbungen, Migrations- und Proliferationsassays, sowie fluorometrische Messungen der cytosolischen Ca2+-Konzentration (Calcium-Imaging). Die zahlenmäßig am stärksten vertretenen Zellpopulationen in Rückenmarkskulturen aus der Maus stellen Astrozyten, Mikroglia-Zellen und Oligodendrozyten. In RT-PCR-Experimenten mit mRNA aus durchflusszytometrisch sortierten GLAST-positiven Rückenmarks-Astrozyten lassen sich Transkripte für TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, und TRPC6 nachweisen. Der TRPC2/3/6/7-Agonist 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol führt in Wildtyp-, und in TRPC3-defizienten Astrozyten zu cytosolischen Ca2+-Signalen, die sich nicht signifikant unterscheiden. Dennoch war sowohl die Migrations-, als auch die Proliferationsrate von Astrozyten aus TRPC3-defizienten Mausen signifikant reduziert. Neben 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol führte auch der TRPC4/5-Agonist EnglerinA zu einem cytosolischen Ca2+-Anstieg in den Astrozyten. Das EnglerinA-induzierte Ca2+-Signal war in TRPC4-defizienten Astrozyten signifikant reduziert, was auf eine funktionelle Expression von TRPC4 in den Astrozyten des Rückenmarks der Maus hinweist. Die TRPC4-defizienten Astrozyten zeigten im Vergleich zu Astrozyten aus dem Rückenmark von Wildtyp-Mäusen eine verminderte Proliferationsfähigkeit, wohingegen die Migrationsfähigkeit unverändert war. Astrozyten aus TRPC1-defizienten Mäusen zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Zellen eine erhöhte basale cytosolische Ca2+-Konzentration, sowie einen signifikant erhöhten Ca2+-Anstieg nach Applikation von EnglerinA. Da heteromere TRPC1/TRPC4-Kanäle eine geringere Ca2+-Permeabilität als homomere TRPC4-Kanäle aufweisen, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass TRPC1 in Astrozyten des Rückenmarks heteromere Kanäle mit TRPC4 bildet. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass Astrozyten aus dem Rückenmark der Maus funktionelle 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol- (TRPC2/3/6/7) und EnglerinA-aktivierte (TRPC1/4) Ca2+-permeable Kationenkanäle exprimieren, die an der Ca2+-Homöostase sowie an der Migration (TRPC3) und Proliferation (TRPC3 und TRPC4) der Zellen beteiligt sind.

Summary The role of TRPC-channels in spinal cord astrocytes The present work deals with the characterization of transient receptor potential (TRP) ion channels in primary astrocytes from the mouse spinal cord using immunocytochemical staining, migration and proliferation assays, as well as fluorometric measurements of the cytosolic Ca2+-concentration (calcium imaging). The most numerous cell populations in mouse spinal cord cultures are astrocytes, microglial cells and oligodendrocytes. Transcripts for TRPC1, TRPC2, TRPC3, TRPC4, and TRPC6 can be detected in RT-PCR experiments with mRNA from flow cytometrically sorted GLAST-positive spinal cord astrocytes. The TRPC2/3/6/7 agonist 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol leads to cytosolic Ca2+-signals in wild-type and TRPC3-deficient astrocytes that do not differ significantly. Nevertheless, both the migration and proliferation rates of astrocytes from TRPC3-deficient mice were significantly reduced. In addition to 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol, the TRPC4/5 agonist EnglerinA also led to a cytosolic Ca2+-increase in astrocytes. EnglerinA-induced Ca2+-signal was significantly reduced in TRPC4-deficient astrocytes, indicating functional expression of TRPC4 in mouse spinal cord astrocytes. The TRPC4-deficient astrocytes showed reduced proliferation ability compared to astrocytes from the spinal cord of wild-type mice, whereas migration ability was unchanged. Compared to wild-type cells, astrocytes from TRPC1-deficient mice showed an increased basal cytosolic Ca2+-concentration, as well as a significantly increased Ca2+-increase after application of EnglerinA. Since heteromeric TRPC1/TRPC4 channels have lower Ca2+-permeability than homomeric TRPC4 channels, this result suggests that TRPC1 forms heteromeric channels with TRPC4 in spinal cord astrocytes. In summary, the present work shows that astrocytes from the mouse spinal cord express functional 1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (TRPC2/3/6/7) and englerinA-activated (TRPC1/4) Ca2+-permeable cation channels, which are involved in Ca2+-homeostasis as well as in cell migration (TRPC3) and proliferation (TRPC3 and TRPC4).