Die Wirkung von Ellagsäure und Indol-3-Carbinol auf Endometrioseherde im Mausmodell

Abstract

Die Endometriose ist eine hormonabhängige Erkrankung, bei der sich Gebärmutterschleimhaut (En- dometrium) außerhalb der Gebärmutterhöhle (Cavum uteri) befindet. Häufige Lokalisationen sind hierbei das Peritoneum im kleinen Becken, die Haltebänder der Gebärmutter, die Eierstöcke (Ovarien) und der Douglasraum. Je nach Lokalisation leiden die betroffenen Patientinnen an unterschiedlichen Beschwerden. Mitunter können sie auch asymptomatisch sein. Leitsymptome sind eine schmerzhafte Menstruation (Dysmenorrhö), Zyklusanomalien, wie Menorrhagie und Hypermenorrhö, Schmerzen beim Geschlechtsverkehr (Dyspareunie) und vor allem chronische Unterbauchschmerzen. Oftmals geht eine Infertilität mit der Erkankung einher. Aufgrund des Einflusses von Östrogen auf das hor- monsensitive Endometriumgewebe manifestieren sich die Beschwerden hauptsächlich bei Frauen im gebärfähigen Alter. Hohe Prävalenzen finden sich mit 25-50% bei infertilen Frauen, wobei von einer weltweiten Prävalenz von 6-10% ausgegangen wird. Ätiologisch betrachtet gibt es verschiedene Theo- rien, welche die Entstehung einer Endometriose erklären. Die geläufigste Theorie stammt dabei von Sampson. Demnach wird durch retrograde Menstruation das Endometriumgewebe durch die Eileiter (Tuben) in die Bauchhöhle transportiert und wächst dort an. Nach neuesten Erkenntnissen sind hormonelle, immunologische und entzündliche Prozesse in der Pathogenese der Endometriose von großer Bedeutung. Entsprechend weist sie Gemeinsamkeiten zu Tumorerkrankungen auf, obwohl sie eine benigne Erkrankung ist. Ein entscheidender Prozess ist das Wachstum von Gewebe (Proliferation) in Verbindung mit der Bildung neuer Blutgefäße (Angioge- nese), denn für die Proliferation ist eine Versorgung mit Nährstoffen über die Blutgefäße essenziell. Somit konzentriert sich die Endometriose-Forschung in den letzten Jahren zunehmend auf Behand- lungsmöglichkeiten, welche anti-angiogene und anti-proliferative Therapieansätze beinhalten. Bereits vorhandene anti-angiogene Medikamente, die auch zur onkologischen Behandlung eingesetzt werden, weisen allerdings erhebliche Nebenwirkungen auf und können die weiblichen Reproduktionsorgane stark beeinträchtigen. Ein Fokus liegt daher auf Phytosubstanzen, welche die proliferativen und an- giogenen Signalwege signifikant hemmen können und meist besser verträglich sind. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Wirkungen der Phytosubstanzen Ellagsäure (ES) und Indol- 3-Carbinol (I3C) auf das Wachstum und die Angiogenese von Endometrioseherden im Mausmodell zu untersuchen. Hierzu wurden uterine Gewebeproben aus Spendermäusen syngen in die Bauchhöhle von BALB/c-Mäusen transplantiert. Während des gesamten Untersuchungszeitraumes erhielten die Tiere täglich eine intragastrale Substanzapplikation. Die Wirkung der Phytosubstanzen auf die En- dometrioseherde wurde jeweils in zwei Experimenten mit einem Untersuchungszeitraum von 7 und 28 Tagen analysiert. Über einen Zeitraum von 28 Tagen wurde einmal wöchentlich die Größenentwicklung der Endometrioseherde sonographisch analysiert. Danach wurden die Herde exzidiert und für weitere histologische, immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen aufberei- tet. Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbungen ermöglichten dabei die Beurteilung der Gewebemorphologie. Mittels cluster of differentiation (CD)31-Färbung wurde die Blutgefäßdichte der Endometrioseher- de bestimmt. Zusätzliche Ki67-Färbungen dienten der Quantifizierung proliferierender Stroma- und Drüsenzellen und Ki67/CD31-Doppelfärbungen der Bestimmung proliferierender Endothelzellen in den Endometrioseherden. Zur Beurteilung von anti-angiogenen, anti-inflammatorischen und anti- proliferativen Effekten wurde außerdem die Expression verschiedener Proteine mittels Western Blot bestimmt. In einem ersten Studienabschnitt wurde die Wirkung von ES auf das transplantierte Uterusgewebe untersucht. Hierbei zeigte sich eine verringerte Wachstumsrate der induzierten Endometrioseherde nach 21 Tagen im Ultraschall. Zurückzuführen ist dies auf eine Hemmung der stromalen Proliferation nach 7 Tagen und eine Tendenz zur Inhibition der Angiogenese nach 28 Tagen. Es konnte dabei eine erhöhte Expression von vascular endothelial growth factor (VEGF) und vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)2 in den ES-behandelten Tieren nachgewiesen werden. Dies kann als nega- tive Rückkopplung des Gewebes auf die Unterdrückung der Angiogenese durch ES gedeutet werden. Des Weiteren ist es denkbar, dass ES die Apoptose förderte und somit zur Wachstumshemmung der Endometrioseherde beitrug, da eine erhöhte Expression von nuclear factor-kappa B (NF-κB) in den ES-behandelten Tieren nachgewiesen wurde. In einem zweiten Studienabschnitt wurde die Wirkung von I3C auf das transplantierte Uterusgewebe untersucht. Hierbei konnte ebenfalls eine frühe Hemmung der Proliferation stromaler Endometri- umzellen an Tag 7 festgestellt werden. Des Weiteren inhibierte I3C an Tag 7 die endotheliale Zell- proliferation, was folglich zu einer geringeren Gefäßdichte an Tag 28 führte. Als anti-proliferativer Wirkmechanismus konnte hierbei die Hemmung des phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-Signalwe- ges durch I3C nachgewiesen werden. Dieser Signalweg ist ein zentraler Regulator der Zellproliferation. Des Weiteren wurde in Western Blot-Analysen sowohl eine verringerte Expression von VEGFR2 als auch des nachgeschalteten Targets phosphorylated extracellular-signal regulated kinase (pERK) in I3C-behandelten Endometrioseherden gefunden. Dieses Ergebnis zeigt, dass I3C ein wirksamer Inhibi- tor dieses Signalweges ist, welcher bekanntermaßen die Angiogenese in Endometrioseherden reguliert. Diese Ergebnisse zeigen erstmalig, dass ES und I3C die Größenprogredienz von Endometrioseherden in vivo hemmen, indem beide Substanzen die Zellproliferation und Angiogenese über unterschiedliche Mechanismen inhibieren. Somit stellen beide Substanzen vielversprechende Kandidaten zur zukünf- tigen Behandlung der Endometriose dar.

Endometriosis is a hormone-dependent disease, in which endometrial tissue (endometrium) is found outside the uterine cavity (cavum uteri). Common localizations are the peritoneum in the pelvis, the ligaments of the uterus, the ovaries and the pouch of Douglas. The symptoms vary depending on the localization. Sometimes patients may also be asymptomatic. However, the main symptoms are painful menstruation (dysmenorrhea), cycle abnormalities, such as menorrhagia and hypermenorrhea, pain during intercourse (dyspareunia), infertility and, above all, chronic pelvic pain. Due to the influence of estrogens on the hormone-sensitive endometrial tissue, the symptoms are mainly found in women of childbearing age. High prevalence rates of 25-50% are found in infertile women, assuming a worldwide prevalence of 6-10%. From an etiological point of view, there are various theories that can be responsible for the development of the disease. The most common theory is from Sampson. According to his theory, a retrograde menstruation is suspected, during which endometrial cells are carried along the fallopian tubes into the abdominal cavity, where they start to grow. According to the latest findings, hormonal, immunological and inflammatory processes are of major importance in the pathogenesis of endometriosis. Therefore, it shares similarities to the development and progression of tumor diseases, although it represents a benign disease. A crucial process is the growth of tissue (proliferation) in connection with the formation of new blood vessels (angiogenesis), because the supply of nutrients via blood vessels is essential for proliferation. Thus, in recent years, endometriosis research has increasingly focused on treatment options that include anti-angiogenic and anti-proliferative therapeutic approaches. However, existing anti-angiogenic drugs, which are also used for oncological treatment, have considerable side effects and can strongly influence the female reproductive organs. This problem may be overcome by the use of phytosubstances, which can significantly suppress proliferative and angiogenic signaling pathways and are usually better tolerated in terms of their side effects. Therefore, the aim of this thesis was to investigate the effects of the phytosubstances ellagic acid (ES) and indole-3-carbinol (I3C) on the growth and angiogenesis of endometriotic lesions in a mouse model. For this purpose, uterine tissue samples were syngeneically transplanted into the abdominal cavity of BALB/c mice. During the entire study period, the animals received a daily intragastric application of the compounds. Over a period of 28 days, the size of the newly developing endometriotic lesions was analyzed sonographically once a week. At the end of the experiments, tissue samples were excised and further processed for histological, immunohistochemical and molecular biological investigations. Hematoxylin-eosin (HE) staining enabled the analysis of tissue morphology. By means of cluster of differentiation (CD)31 stainings the microvessel density of endometriotic lesions was assessed. In addition Ki67 stainings were used to quantify proliferating stromal and glandular cells and Ki67/CD31 double stainings to determine proliferating endothelial cells within the lesions. For the assessment of anti-angiogenic, anti-inflammatory or anti-proliferative effects, the expression of various proteins was determined by means of Western blot. In the first section of this thesis, the effect of ES on the transplanted uterine tissue samples was examined. After 21 days, a reduced growth rate of the induced endometriotic lesions was detected by means of ultrasound. This was due to the inhibition of stromal proliferation after 7 days and a tendency towards the suppression of angiogenesis after 28 days. An increased expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)2 was detected in animals treated with ES. This may be interpreted as a negative feedback loop of the tissue as reaction to the suppression of angiogenesis by ES. Furthermore, it is conceivable that ES promotes apoptosis by upregulating the expression of nuclear factor-kappa B (NF-κB) and thus, contributes to the growth inhibition of endometriotic lesions, as an increased expression of NF-κB was detected in ES-treated animals. In the second section of this thesis, the effect of I3C on the transplanted uterine tissue samples was investigated. An early inhibition of the proliferation of stromal endometrial cells was found on day 7. Furthermore, I3C inhibited the proliferation of endothelial cells on day 7, which resulted in a lower microvessel density on day 28. Two different signaling pathways can be considered as a possible antiproliferative mechanism of action of I3C. On the one hand, I3C inhibits the PI3K signaling pathway and on the other hand, I3C downregulates VEGFR2, whereby the extracellular-signal regulated kinase (ERK) signaling pathway is also inhibited. These findings demonstrate for the first time that ES and I3C reduce the growth of endometriotic lesions in vivo, because both substances inhibit proliferation and angiogenesis via different mechanisms. Accordingly, they represent promising candidates for the future treatment of endometriosis.