Pre-existing endometriotic lesions promote the development of new lesions in the abdomen of mice

Abstract

Endometriosis is a gynecological disease, which is defined by the development of endometriotic lesions outside the uterine cavity. Up to 20% of women of reproductive age are affected and show symptoms like dysmenorrhea, dyspareunia and infertility. This markedly reduces their quality of life. The reliable diagnosis of the disease can only be confirmed by laparoscopic surgery and histopathological analysis of tissue samples. Hence, several years can pass until patients are diagnosed correctly. The development of endometriosis is widely believed to be promoted by the process of retrograde menstruation according to the implantation theory of Sampson. This theory suggests that endometrial tissue fragments are transported to the abdominal cavity through the fallopian tubes and attach to the peritoneum, where they finally develop into endometriotic lesions. These lesions have been shown to change the peritoneal micromilieu. This thesis analyzed if the presence of pre-existing endometriotic lesions supports the growth of new lesions. It also investigated if this is caused by an altered peritoneal environment or by an exchange of cells between individual lesions. To test this, uterine tissue samples from FVB/N wild-type donor mice were transplanted simultaneously or time-delayed by 14 days with samples from transgenic FVB-Tg(CAG-luc-GFP)L2G85Chco/J donor mice into the abdomen of FVB/N wild-type recipient mice. The development of the lesions was monitored by using high-resolution ultrasound, bioluminescence imaging, histology and immunohistochemistry. Next, a peritoneal lavage was performed in additional FVB/N wild-type recipient mice in order to examine the peritoneal conditions after the induction of endometriotic lesions. For this, uterine tissue samples from transgenic FVB-Tg(CAG-luc-GFP)L2G85Chco/J donor mice were transplanted into the abdomen of recipient mice and peritoneal lavages were performed before and 14 days after transplantation. Flow cytometry and a cytokine array were used to assess the fraction of immune cells and levels of inflammatory cytokines in the peritoneal fluid. The performed analyses showed that the growth of newly developing endometriotic lesions is promoted by the intraperitoneal presence of pre-existing ones. In fact, the time-delayed transplantation of uterine tissue samples resulted in higher growth rates of newly developing endometriotic lesions when compared to simultaneous transplantation. However, this cannot be explained by a cellular exchange between both lesion types (luciferase-positive lesions derived from FVB-Tg(CAG-luc-GFP)L2G85Chco/J mice and luciferase-negative lesions derived from FVB/N wild-type mice), because no bioluminescent signals could be detected outside the luciferase-positive lesions. Therefore, this observation was rather caused by peritoneal inflammation, which was induced by the pre-existing lesions. In line with this view, the analysis of peritoneal fluid after the induction of endometriotic lesions showed increased levels of several cytokines, such as B-lymphocyte chemoattractant (BLC), tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1), interleukin (IL)-5 and IL-23, when compared to baseline conditions (before the induction of endometriotic lesions). Additionally, the performed flow cytometry showed a high fraction of Gr1-positive granulocytes in the peritoneal fluid after 14 days since the induction of endometriotic lesions. These findings indicate that, in addition to other pathomechanisms, the development of endometriosis is driven by a lesion-induced peritoneal inflammation, which creates favorable conditions for the growth of new lesions.

Die Endometriose ist eine gynäkologische Erkrankung, die durch die Entstehung von Endometrioseherden außerhalb der Uterushöhle gekennzeichnet ist. Bis zu 20% der Frauen im gebärfähigen Alter sind davon betroffen und zeigen Symptome wie Dysmenorrhoe, Dyspareunie und Infertilität. Dies beeinträchtigt ihre Lebensqualität deutlich. Die sichere Diagnose der Krankheit kann nur durch einen invasiven laparoskopischen Eingriff und eine histopathologische Untersuchung von Gewebeproben gestellt werden. Daher können mehrere Jahre vergehen, bis die Patientinnen die richtige Diagnose erhalten. Es wird allgemein angenommen, dass die Entstehung einer Endometriose durch retrograde Menstruation gemäß der Implantationstheorie von Sampson gefördert wird. Diese Theorie besagt, dass Fragmente von Endometriumgewebe durch die Eileiter in die Bauchhöhle transportiert werden und sich am Bauchfell festsetzen, wo sie sich schließlich zu Endometrioseherden entwickeln. Es wurde somit gezeigt, dass die Herde das peritoneale Mikromilieu verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob bereits bestehende Endometrioseherde das Wachstum neuer Herde fördern. Außerdem wurde überprüft, ob dies auf ein verändertes peritoneales Milieu oder auf einen Zellaustausch zwischen einzelnen Herden zurückzuführen ist. Zu diesem Zweck wurden Uterusgewebeproben von FVB/N-Wildtyp-Spendermäusen gleichzeitig oder um 14 Tage zeitversetzt mit Proben von transgenen FVB-Tg(CAG-luc- GFP)L2G85Chco/J-Spendermäusen in die Bauchhöhle von FVB/N-Wildtyp- Empfängermäusen transplantiert. Die Entwicklung der Herde wurde mittels hochauflösendem Ultraschall, Biolumineszenz-Bildgebung, Histologie und Immunhistochemie analysiert. Darüber hinaus wurde bei weiteren FVB/N-Wildtyp-Empfängermäusen eine Peritoneallavage durchgeführt, um die peritonealen Bedingungen nach der Induktion von Endometrioseherden zu untersuchen. Dazu wurden Uterusgewebeproben von transgenen FVB-Tg(CAG-luc- GFP)L2G85Chco/J Spendermäusen in die Bauchhöhle der Empfängertiere transplantiert und Peritoneallavagen vor und 14 Tage nach der Transplantation durchgeführt. Um den Anteil von Immunzellen und Entzündungsmediatoren in der Peritonealflüssigkeit zu bestimmen, erfolgte eine Durchflusszytometrie und ein Zytokin-Array. Diese Untersuchungen zeigten, dass das Wachstum neuer Endometrioseherde durch das intraperitoneale Vorhandensein bereits bestehender Herde gefördert wird. Tatsächlich führte die zeitlich verzögerte Transplantation von Uterusgewebeproben zu höheren Wachstumsraten von sich neu entwickelnden Endometrioseherden im Vergleich zur gleichzeitigen Transplantation. Dies konnte jedoch nicht durch einen Zellaustausch zwischen beiden Herdtypen (Luciferase-positive Herde aus FVB-Tg(CAG-luc-GFP)L2G85Chco/JGewebe und Luciferase-negative Herde aus FVB/N-Gewebe) erklärt werden, da außerhalb der Luciferase-positiven Herde keine Biolumineszenz-Signale nachgewiesen werden konnten. Daher war diese Beobachtung eher auf eine peritoneale Entzündung zurückzuführen, die durch die bereits bestehenden Herde ausgelöst wurde. In Übereinstimmung damit zeigte die Analyse der Peritonealflüssigkeit nach der Induktion von Endometrioseherden erhöhte Konzentrationen von Zytokinen, wie B-Lymphozyten- Chemoattraktant (BLC), Gewebe-Inhibitor von Metalloproteinasen 1 (TIMP-1), Interleukin (IL)- 5 und IL-23 im Vergleich zu den Ausgangsbedingungen (vor der Induktion von Endometrioseherden). Darüber hinaus zeigten durchflusszytometrische Analysen einen hohen Anteil an Gr1-positiven Granulozyten in der Peritonealflüssigkeit 14 Tage nach der Induktion von Endometrioseherden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Entwicklung einer Endometriose neben anderen Pathomechanismen durch eine herdinduzierte peritoneale Entzündung vorangetrieben wird, die günstige Bedingungen für das Wachstum neuer Herde schafft.