PI3K-Inhibitoren in der Therapie des PIK3CA-mutierten Mammakarzinoms: Methodischer Vergleich molekularpathologischer Analyseverfahren zur Detektion von PIK3CA-Varianten aus Langzeit-asserviertem Tumorgewebe

Abstract

Einleitung Das Mammakarzinom ist das häufigste Karzinom der Frau. Neben den konventionellen Therapieansätzen steht, nach der SOLAR1 Studie von Andre et al. aus dem Jahr 2019, mit dem PI3K-Inhibitor Alpelisib in Kombination mit Fulvestrant seit 2020 eine weitere Behandlungsmöglichkeit für das PIK3CA-mutierte, Hormonrezeptorpositive, HER2neu-negative, endokrin vortherapierte, lokal fortgeschrittene oder metastasierte Mammakarzinom zur Verfügung. Voraussetzung für den Einsatz dieser Medikamentenkombination ist der vorherige Nachweis einer PIK3CA-Mutation durch „liquid-biopsy“, oder aus einer Gewebeprobe. Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei Alpelisib um eine Zweitlinientherapie handelt, welche erst 2020 zugelassen wurde, findet eine solche Testung aktuell vor allem nachträglich aus asserviertem, formalin-fixierten und paraffin-eingebetteten Tumorgewebe statt. Vor diesem Hintergrund ist es Ziel dieser methodischen Arbeit die Validität der drei gängigsten Methoden, Sequenzierung nach Sanger, Echtzeit-PCR und das „Next-Generation-Sequencing“, für den Nachweis oder Ausschluss von PIK3CA-Mutationen im Langzeit-archiviertem Tumorgewebe zu vergleichen und somit möglicherweise eine präferenzielle Empfehlung für die molekularpathologische Diagnostik zu geben. Material und Methodik Untersucht wurde in neutral-gepuffertem Formalin fixiertes und in Paraffin eingebettetes Überschussmaterial von Mamma-Resektaten aus den Jahren 2006 bis 2011. Das Untersuchungsmaterial besteht in dieser Arbeit ausschließlich aus DNA-Proben, welche aus nicht-spezifischer-Typ- (NST) lobulären und kombinierten Karzinomen der Mamma isoliert wurden. Das verwendete Probenmaterial wurde ursprünglich in der Klinik für Frauenheilkunde, Geburtshilfe und Reproduktionsmedizin (Leitung: Prof. Dr. E.-F. Solomayer) am Universitätsklinikum des Saarlandes (UKS) gewonnen und im Institut für Allgemeine und Spezielle Pathologie am UKS (Leitung: Prof. Dr. Rainer M. Bohle) nach leitliniengerechter Diagnostik untersucht. In dieser Arbeit wurden die Proben mittels Sequenzierung nach Sanger, Quantitativer Echtzeit-PCR und Next-Generation-Sequencing (NGS) untersucht. Anschließend wurden die molekulargenetischen Untersuchungsmethoden unabhängig voneinander im Hinblick auf die Mutationsfrequenz unter Berücksichtigung der Mutationsloki Exon 7, Exon 9 und Exon 20 des PIK3CA und der intrinsischen Subtypen Luminal A, Luminal B, HER2-positiv und Triple-negativ ausgewertet. Zusätzlich wurde mittels Cohens´s Kappa die Reliabilität der drei verwendeten PIK3CA-Mutationsanalyseverfahren statistisch ermittelt. Ergebnisse Von den 59 Patientinnen gehören 22 zu der Gruppe HR-positiv und HER2/neu-negativ. Das Vorhandensein eines PIK3CA-Pseudogens auf dem Chromosom 22 erschwerte die Mutationsanalyse mittels Sequenzierung nach Sanger. Bei circa 75% der Proben konnte mittels Sequenzierung nach Sanger das Exon 9 des PIK3CA nicht vollständig analysiert werden. In der Echtzeit-PCR konnte eine Probe nicht analysiert werden. Mit der NGS konnten alle Patientinnen-Proben analysiert werden. Die Sensitivität der Sequenzierung nach Sanger lag in dieser Arbeit bei 33%. Die Spezifität liegt in dieser Arbeit für die Sequenzierung nach Sanger bei 100%. Die Quantitative Echtzeit-PCR und das Next-Generation-Sequencing hatten nach Altman eine sehr gute und nach Landis und Koch eine fast perfekte Reliabilität. Schlussfolgerung Zusammenfassend ergibt sich, dass für eine primär separate PIK3CA-Mutationsanalyse aus mehrere Jahre als Paraffinblock asserviertem Tumorgewebe zunächst die Sequenzierung nach Sanger verwendet werden sollte. Falls die Sequenzierung nach Sanger den Wildtyp oder ein inkomplettes Ergebnis nachweist, sollte eine erneute Analyse mittels NGS stattfinden. Detektiert die Sequenzierung nach Sanger eine Mutation, ist keine weitere Analyse notwendig.

Introduction Breast cancer is the most common cancer in women. In addition to conventional treatment approaches, the PI3K inhibitor alpelisib in combination with fulvestrant has been available since 2020 as a further treatment option for PIK3CA-mutated, hormone receptor-positive, HER2-negative, endocrine-pretreated, locally advanced or metastatic breast cancer following the SOLAR1 study by Andre et al. in 2019. The prerequisite for the use of this drug combination is the prior detection of a PIK3CA mutation by liquid biopsy or from a tissue sample. Since alpelisib is a second-line therapy that was only approved in 2020, such testing is currently mainly carried out retrospectively from preserved excess tissue. Against this background, the aim of this methodological work is to practically compare the three established methods, sequencing according to Sanger, real-time PCR and next-generation sequencing, for this application and thus provide a recommendation for practice. Methods and Material Excess material from breast resections obtained between 2006 to 2011. The tissue analyzed was formalin-fixed and paraffin-embedded. The test material in this study consists exclusively of DNA samples isolated from lobular, NST and combined carcinomas of the breast. The sample material used was originally obtained at the Department of Gynaecology, Obstetrics and Reproductive Medicine (Head: Prof. Dr E.-F. Solomayer) at Saarland University Hospital (UKS) and examined at the Institute of General and Special Pathology at UKS (Head: Prof. Dr Rainer M. Bohle) according to guideline-based diagnostics. In this study, the samples were analysed using Sanger sequencing, quantitative real-time PCR and next-generation sequencing. The molecular genetic examination methods were then analysed independently of each other regarding detection of mutation frequency at loci in the PIK3CA gene in exon 7, exon 9 and exon 20 in the intrinsic breast cancer subtypes luminal A, luminal B, HER2-positive and triple-negative. In addition, the reliability of the three PIK3CA mutation analysis methods used was calculated and statistically analysed using Cohen's Kappa. Results Of the 59 patients, 22 belonged to the HR-positive and HER2/neu-negative group. The presence of a PIK3CA pseudogene on chromosome 22 made it difficult to analyse the mutation using Sanger sequencing. In approximately 75% of the samples, exon 9 could not be fully analysed by Sanger sequencing. One sample could not be analysed using quantitative real-time PCR. All patient samples could be analysed using NGS. The sensitivity of Sanger sequencing in this study was 33%. The specificity for Sanger sequencing in this study was 100%. Next-generation-sequencing and real-time PCR showed a very good reliability according to Altman and almost perfect reliability according to Landis and Koch. Conclusion In summary, Sanger sequencing should initially be used for a PIK3CA mutation analysis from long time preserved paraffin-embedded tumour tissue. If Sanger sequencing is negative or detects only the wild type gene, a new analysis should be performed using NGS. If Sanger sequencing detects a mutation, no further analysis is necessary.