Investigating Calcium Dependent Regulation of IL-1α Release: Unravelling the Significant Role of Purinergic Signaling with Implications in Chronic Kidney Disease.

Abstract

Chronic kidney disease (CKD) is characterized by irreversible changes in kidney function persisting for more than three months. Lethal cardiovascular events in CKD patients account for 7.6% of cardiovascular disease-related deaths. Elevated levels of IL-1α have been observed in monocytes of CKD patients. In this study, we aimed to investigate the importance of Ca²⁺ signals in IL-1α biogenesis and release, as well as the channels mediating these signals and their alterations in monocytes from CKD donors. Moreover, IL-1α localization in monocytes and transcriptional alterations associated with CKD were investigated. To investigate the importance of Ca²⁺ in IL-1α release, concentrations of IL-1α and IL-1β released in the medium upon chelating Ca²⁺ with EGTA or BAPTA-AM were measured using ELISA, showing a significant reduction in both cytokines when intracellular Ca²⁺ was chelated. Inhibition of calpain, a Ca²⁺-dependent protease known to cleave IL-1α, showed a significant reduction in IL-1α in the medium, but had no effect on IL-1β. Moreover, Ca²⁺ signaling through three main Ca²⁺ pathways, including TRPM2, store-operated calcium entry (SOCE), and the purinergic family, were investigated using live-cell Ca²⁺ imaging. Although no significant alterations were observed in expression levels or Ca²⁺ signals via SOCE or TRPM2 in CKD monocytes, purinergic signaling was significantly increased compared to control cells. Expression analysis using qPCR showed higher expression levels of P2Y11, P2X4, and P2X7 in monocytes from CKD patients. Our results showed that the activation of P2X7 is crucial for IL-1α release, and inhibition of P2X7 and to a lesser extent P2X4 reduced IL-1α and IL-1β release from monocytes. Analysis of monocyte surface markers showed alterations of the fraction of CD16⁺ monocytes following priming and treatment with ATP in CKD monocytes. The current work also studied the effects of several kinases activated downstream of the P2 family on IL-1α release and surface expression. Release of IL-1α but not IL-1ß was significantly inhibited by PKCβ2 inhibition. Moreover, surface expression of IL-1α and the CD16 marker were increased upon NFκB inhibition. RNA sequencing results identified 143 up-regulated and 79 downregulated genes in CKD monocytes. Among these, MMP25 and MMP9 were significantly up-regulated. Incubating LPS-primed cells with an MMP pan-inhibitor led to a significant decrease in IL-1α release while an increased surface expression of IL-1α was observed only if the inhibitor was included during priming with LPS. 11 To explore intracellular localization, IL-1α was overexpressed with a GFP tag at the N-terminus and mCherry at the C-terminus in HEK293 cell line or primary monocytes. We observed nuclear localization of IL-1α in mature monocytes with a bean-shaped nucleus and cytoplasmic localization in immature monocytes with a round nucleus. In conclusion, our findings highlight the pivotal role of P2X4, P2X7, PKCβ2, and MMPs in IL-1α release and surface expression. Additionally, we observed a strong correlation between CD16 and IL-1α surface expression.

Zusammenfassung: Die chronische Nierenerkrankung (CKD) ist durch irreversible Veränderungen der Nierenfunktion gekennzeichnet, die länger als drei Monate andauern. Tödliche kardiovaskuläre Ereignisse bei CKD-Patienten machen 7.6 % der an Herz-Kreislauf-Erkrankungen bedingten Todesfälle aus. Bei den Monozyten von CKD-Patienten wurden erhöhte IL‑1α Spiegel beobachtet. In dieser Studie wollten wir die Bedeutung von Ca²⁺ Signalen für die Biogenese und Freisetzung von IL‑1α untersuchen, ebenso wie die Kanäle, die diese Signale vermitteln, und deren Veränderungen in Monozyten von CKD Spendern. Darüber hinaus wurden die Lokalisation von IL‑1α in Monozyten und die mit CKD assoziierten transkriptionellen Veränderungen analysiert. Um die Bedeutung von Ca²⁺ bei der Freisetzung von IL‑1α zu untersuchen, wurden mittels ELISA die Konzentrationen von IL‑1α und IL‑1β gemessen, die nach der Chelatierung von Ca²⁺ mit EGTA oder BAPTA‑AM in das Medium freigesetzt wurden. Dabei zeigte sich, dass beide Zytokine signifikant reduziert wurden, wenn das intrazelluläre Ca²⁺ gecheliert wurde. Die Hemmung von Calpain, einer Ca²⁺ abhängigen Protease, die dafür bekannt ist, IL‑1α zu spalten, führte zu einer signifikanten Verringerung von IL‑1α im Medium, während IL‑1β unbeeinflusst blieb. Außerdem wurde die Ca²⁺ Signalübertragung über drei Hauptwege: TRPM2, store-operated calcium entry (SOCE) und die purinerge Familie, mittels Live-Cell-Ca²⁺-Imaging untersucht. Obwohl in CKD Monozyten weder signifikante Veränderungen der Expressionsniveaus noch der Ca²⁺ Signale über SOCE oder TRPM2 festgestellt wurden, war die purinerge Signalübertragung im Vergleich zu Kontrollzellen signifikant erhöht. Eine Expressionsanalyse mittels qPCR ergab zudem höhere Expressionsniveaus von P2Y11, P2X4 und P2X7 in den Monozyten von CKD-Patienten. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung von P2X7 entscheidend für die Freisetzung von IL‑1α ist und dass die Hemmung von P2X7 – und in geringerem Maße von P2X4 , die Freisetzung von IL‑1α und IL‑1β aus den Monozyten reduziert. Die Analyse der Oberflächenmarker der Monozyten ergab Veränderungen im Anteil der CD16⁺ Monozyten nach dem Priming und der Behandlung mit ATP in CKD-Monozyten. Die vorliegende Arbeit untersuchte zudem die Effekte mehrerer Kinasen, die nachgeschaltet der P2 Familie aktiviert werden, auf die Freisetzung und Oberflächenexpression von IL‑1α. So wurde die Freisetzung von IL‑1α, nicht aber die von IL‑1β, durch die Hemmung von PKCβ2 signifikant reduziert. Darüber hinaus führte die Hemmung von NFκB zu einer erhöhten Oberflächenexpression von IL‑1α und des CD16‑Markers. RNA Sequenzierungsergebnisse 13 identifizierten 143 hochregulierte und 79 herunterregulierte Gene in CKD Monozyten. Unter diesen waren MMP25 und MMP9 signifikant hochreguliert. Die Inkubation von LPS geprimten Zellen mit einem MMP‑Pan‑Inhibitor führte zu einer signifikanten Abnahme der IL‑1α Freisetzung, während eine erhöhte Oberflächenexpression von IL‑1α nur beobachtet wurde, wenn der Inhibitor bereits während des Primings mit LPS hinzugefügt wurde. Um die intrazelluläre Lokalisation zu untersuchen, wurde IL‑1α in der HEK293‑Zelllinie oder in primären Monozyten überexprimiert, wobei ein GFP Tag am N‑Terminus und mCherry am C‑Terminus angefügt wurde. Dabei beobachteten wir in reifen Monozyten mit bohnenförmigem Zellkern eine nukleäre Lokalisation von IL‑1α, während in unreifen Monozyten mit rundem Zellkern eine zytoplasmatische Lokalisation vorherrschte. Zusammenfassend heben unsere Ergebnisse die zentrale Rolle von P2X4, P2X7, PKCβ2 und MMPs bei der Freisetzung und Oberflächenexpression von IL‑1α hervor. Zudem wurde eine starke Korrelation zwischen der Oberflächenexpression von CD16 und IL‑1α festgestellt.