High-resolution Immuno Electron Microscopic Analyses of Synaptic Ribbons in the Mouse Retina

Abstract

Ribbon synapses are specialized chemical synapses in vertebrates that facilitate a tonic release of neurotransmitter. The specialized organelle that is responsible for constantly providing new ready-for-release synaptic vesicles is called the synaptic ribbon and can be seen with the help of a transmission electron microscope as an electron-dense structure. It is found adjacent to the active zone (Wagner, 1997) in the presynaptic terminal of photoreceptors and bipolar cells in the retina, hair cells in the inner ear and pinealocytes in the pineal gland in the brain (Smith and Sjöstrand, 1961, Hopsu and Arstila, 1965, Matthews and Fuchs, 2010). The main protein component of synaptic ribbons is the RIBEYE scaffolding protein (Schmitz et al., 2000). RIBEYE consists of a unique N-terminal proline-rich A-Domain and a C-terminal B-Domain which is almost identical to the transcriptional regulator protein CtBP2 (Schmitz et al., 2000). RIBEYE is only expressed in ribbon synapses whereas CtBP2 is a ubiquitously expressed protein found in nearly all eukaryotic cells. An assembly model, which was hypothesized by Schmitz et al. in 2000, suggests that the RIBEYE A-Domains build the synaptic ribbon around the core, due to their various binding sites for other RIBEYE proteins and the RIBEYE B-Domains lie on the surface of the ribbon, where they interact with NADH and multiple different proteins in the presynaptic terminal. The goal of the present study was to refine this working hypothesis by using high resolution immuno electron microscopy to analyze possible differences in distribution of the RIBEYE A- and B-Domain across the width of the synaptic ribbon in photoreceptor synapses of the mouse retina. In order to achieve high resolution, 5 nm colloidal gold was directly conjugated to the primary antibodies, 6F4 against the RIBEYE A-Domain and 2D9 against the RIBEYE B-Domain instead of using the indirect immunogold labelling technique. Immunogold-labelled synaptic ribbons were then analyzed with a Python-based analytic software, concerning the distances of the gold particles from the midline of the synaptic ribbon in relation to the width of the ribbon. The results showed no differences in distribution between the RIBYEYE A- and B-Domain across the width of the synaptic ribbon, leading to the conclusion, that RIBEYE A-Domain and RIBEYE B-Domain are located in similar distances from the midline of the synaptic ribbon.

Ribbon-Synapsen sind spezialisierte chemische Synapsen in Wirbeltieren, die eine tonische Freisetzung von Neurotransmittern ermöglichen. Das spezialisierte Organell, das ständig neue, freisetzungsbereite synaptische Vesikel bereitstellt, wird synaptisches Ribbon genannt. Es kann mithilfe eines Transmissionselektronenmikroskops als elektronen-dichte Struktur dargestellt werden. Es liegt in der Nähe der aktiven Zone (Wagner, 1997) im präsynaptischen Endknöpfchen von Photorezeptoren und Bipolarzellen in der Netzhaut, Haarzellen im Innenohr und Pinealozyten in der Zirbeldrüse im Gehirn (Smith und Sjöstrand, 1961, Hopsu und Arstila, 1965, Matthews und Fuchs, 2010). Der Hauptproteinbestandteil der synaptischen Ribbons ist das Gerüstprotein RIBEYE (Schmitz et al., 2000). RIBEYE besteht aus einer einzigartigen N-terminalen Prolin-reichen A-Domäne und einer C-terminalen B-Domäne, die mit dem Transkriptionsregulatorprotein CtBP2 fast identisch ist (Schmitz et al., 2000). RIBEYE wird nur in Ribbon-Synapsen exprimiert, während CtBP2 ein ubiquitär exprimiertes Protein ist, das in nahezu allen eukaryotischen Zellen vorkommt. Ein von Schmitz et al. im Jahr 2000 vorgeschlagenes Modell zum Aufbau des Ribbons legt nahe, dass die RIBEYE A-Domänen das synaptische Ribbon um den Kern herum aufbauen, da sie über verschiedene Bindungsstellen für andere RIBEYE-Proteine verfügen, und die RIBEYE B-Domänen sich an der Oberfläche des Ribbons befinden, wo sie mit NADH und verschiedenen Proteinen im präsynaptischen Endknöpfchen interagieren. Ziel der vorliegenden Studie war es, diese Arbeitshypothese zu verfeinern, indem mittels hochauflösender Immun-Elektronenmikroskopie mögliche Unterschiede in der Verteilung der RIBEYE A- und B-Domäne über die Breite des synaptischen Ribbons in den Photorezeptorsynapsen der Mäusenetzhaut analysiert wurden. Um eine hohe Auflösung zu erreichen, wurde kolloidales Gold mit einem Durchmesser von 5 nm direkt an die Primärantikörper, 6F4 gegen die RIBEYE A-Domäne und 2D9 gegen die RIBEYE B-Domäne, gekoppelt, anstatt die indirekte Immunogold-Markierungstechnik zu verwenden. Immunogold-markierte synaptische Ribbons wurden dann mithilfe einer Python-basierten Analysesoftware hinsichtlich der Abstände der Goldpartikel von der Mittellinie des synaptischen Ribbons in Relation zur Breite des Ribbons analysiert. Die Ergebnisse zeigten keine Unterschiede in der Verteilung zwischen der RIBEYE A- und B-Domäne über die Breite des synaptischen Ribbons. Die Schlussfolgerung ist, dass die RIBEYE A-Domäne und die RIBEYE B-Domäne in ähnlichen Abständen von der Mittellinie des synaptischen Ribbons lokalisiert sind.