Modulation of Alzheimer's Disease Brain Pathology in Mice by Gut Bacterial Deletion: The Role of IL-17a

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia in the elderly. It is pathologically characterised by extracellular deposition of amyloid-β peptides (Aβ), intracellular neurofibrillary tangles primarily composed of hyperphosphorylated tau protein, and microglial activation in the brain parenchyma. Recent studies have also shown that the composition of bacteria in the gut of AD patients and animals changes in correlation with inflammatory status in the blood and the severity of AD pathology in the brain; however, the molecular mechanisms mediating the pathogenic effects of gut bacteria in AD remains unclear.

Interleukin-17a (IL-17a) is an important cytokine in the gut, which interacts with gut bacteria and protects the host from microbial invasion under physiological conditions; however, dysregulation of IL-17a may also lead to inflammatory disorders in the host by pathological conditions, for example, multiple sclerosis. Our previous study has indicated that IL-17a expression increases in CD4-positive spleen cells in APP-transgenic mice. We hypothesize that IL-17a mediates the effects of gut bacteria on AD pathology in AD mice.

We crossed APP-transgenic mice with Il-17a-knockout mice to create IL-17a-deficient and wild-type AD models. Three-month-old APP-transgenic female mice with different expression of IL-17a were depleted or not of intestinal bacteria by drinking antibiotics-supplemented or normal water for two months. The gut microbiome was analysed by sequencing the bacterial 16S DNA V3-V4 regions, the amount of bacterial DNA in the brain tissue was detected by real-time PCR, and IL-17a-expressing T lymphocytes in the gut were quantified by flow cytometry and in the spleen by quantitative RT-PCR. AD-associated pathologies, i.e., neuroinflammation, Aβ pathology, and neurodegeneration, were investigated by immunohistochemistry, ELISA, Western blot and molecular biology approaches. To further investigate the pathogenic mechanisms, microglial morphology, microglial transcription of disease-associated microglia signature genes, microglial phagocytosis of Aβ, β- and γ-secretase activity, transcription of Aβ-degrading enzyme genes Neprilysin and Insulin-degrading enzyme, and protein levels of Aβ-transporting proteins LRP1 and ABCB1 in the isolated capillaries, were determined.

We have obtained the following major results: 1) The antibiotic treatment eradicated almost all intestinal bacteria, and led to a reduction in bacterial DNA in the brain tissues of both IL-17a-deficient and wild-type APP-transgenic mice; 2) Depletion of gut bacteria reduced IL-17a-expressing CD4-positive T lymphocytes in the spleen and gut in APP-transgenic mice; 3) Depletion of gut bacteria inhibited inflammatory activation in both brain tissue and individual microglia, which were reversed by knockout of Il-17a gene; 4) Depletion of gut bacteria decreased Aβ levels in IL-17a wild-type, but not IL-17a-deficient APP-transgenic mice; 5) Depletion of gut bacteria promoted transcription of Arc gene in the brain of IL-17a wild-type, but not IL-17a-deficient APP-transgenic mice. Arc expression is associated with the improvement of cognitive function.

To further identify possible mechanisms, through which depletion of gut bacteria regulates Aβ pathology, we have the following findings: 1) Depletion of gut bacteria inhibited the β-secretase activity in the brain of IL-17a wild-type, but not IL-17a-deficient APP-transgenic mice, which potentially led to reduced Aβ production; 2) Depletion of gut bacteria increased the expression of ABCB1 and LRP1 in the brain or at the BBB of IL-17a wild-type, but not IL-17a-deficient APP-transgenic mice. ABCB1 and LRP1 are responsible for the Aβ efflux through the blood-brain barrier; 3) Interestingly, knockout of Il-17a gene already increased ABCB1 and LRP1 expression at the blood-brain barrier; 4) Depletion of gut bacteria did not increase microglial Aβ phagocytosis and extracellular Aβ degradation in the brain of APP-transgenic mice.

In conclusion, depletion of gut bacteria attenuates inflammatory activation and amyloid pathology in APP-transgenic mice via IL-17a-involved signalling pathways. Our study contributes to a better understanding of the gut-brain axis in AD pathophysiology and highlights the therapeutic potential of IL-17a inhibition or specific depletion of gut bacteria that stimulate the development of IL-17a-expressing T cells.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Ursache für Demenz bei älteren Menschen. Sie ist pathologisch gekennzeichnet durch extrazelluläre Ablagerungen von Amyloid-β-Peptiden (Aβ), intrazelluläre neurofibrilläre Tangles, die hauptsächlich aus hyperphosphoryliertem Tau-Protein bestehen, und mikrogliale Aktivierung im Gehirnparenchym. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass sich die Zusammensetzung der Bakterien im Darm von AD-Patienten und Tieren in Korrelation mit dem Entzündungsstatus im Blut und dem Schweregrad der Alzheimer-Pathologie im Gehirn verändert; die molekularen Mechanismen, die die pathogenen Wirkungen der Darmbakterien bei AD vermitteln, sind jedoch noch unklar. Interleukin-17a (IL-17a) ist ein wichtiges Zytokin im Darm, das mit Darmbakterien interagiert und den Host unter physiologischen Bedingungen vor mikrobieller Invasion schützt; eine Dysregulation von IL-17a kann jedoch auch zu entzündlichen Störungen im Host unter pathologischen Bedingungen führen, z. B. bei Multipler Sklerose. Unsere frühere Studie hat gezeigt, dass die Expression von IL-17a in CD4-positiven Milzzellen bei APP-transgenen Mäusen zunimmt. Wir stellen die Hypothese auf, dass IL-17a die Auswirkungen von Darmbakterien auf die AD-Pathologie in AD-Mäusen vermittelt. Wir kreuzten APP-transgene Mäuse mit Il-17a-Knockout-Mäusen, um IL-17a-defiziente und Wildtyp-AD-Modelle zu schaffen. Drei Monate alten APP-transgenen weiblichen Darmbakterien in Mäusen mit unterschiedlicher Expression von IL-17a wurden zwei Monate lang durch das Trinken von mit Antibiotika angereichertem oder normalem Wasser entzogen oder nicht. Das Darmmikrobiom wurde durch Sequenzierung der bakteriellen 16S-DNA-V3-V4-Regionen analysiert, die Menge der bakteriellen DNA im Hirngewebe wurde durch Realtime-PCR nachgewiesen, und IL-17a-exprimierende TLymphozyten im Darm wurden durch Durchflusszytometrie und in der Milz durch quantitative Realtime-PCR quantifiziert. AD-assoziierte Pathologien, d. h. Neuroinflammation, Aβ-Pathologie und Neurodegeneration, wurden durch Immunhistochemie, ELISA, Western Blot und molekularbiologische Ansätze untersucht. Um die pathogenen Mechanismen weiter zu untersuchen, wurden die Mikroglia Morphologie, die mikrogliale Transkription von krankheitsassoziierten Mikroglia- Signaturgenen, die mikrogliale Phagozytose von Aβ, die β- und γ-Sekretaseaktivität, die Transkription der Aβ-abbauenden Enzymgene Neprilysin und Insulin-abbauendes Enzym sowie die Proteinkonzentrationen der Aβ-transportierenden Proteine LRP1 und ABCB1 in den isolierten Kapillaren bestimmt. Wir haben die folgenden wichtigen Ergebnisse erzielt: 1) Die Antibiotikabehandlung löschte fast alle Darmbakterien aus, was zu einer Verringerung der bakteriellen DNA im Gehirngewebe sowohl von IL-17adefizienten als auch von Wildtyp-APP-transgenen Mäusen führte; 2) Die Depletion von Darmbakterien reduzierte die IL-17a-exprimierenden CD4- positiven T-Lymphozyten in Milz und Darm von APP-transgenen Mäusen; 3) Die Depletion von Darmbakterien hemmte die entzündliche Aktivierung sowohl im Hirngewebe als auch in einzelnen Mikroglia, was durch Knockout des Il-17a- Gens umgekehrt wurde; 4) Die Depletion von Darmbakterien verringerte den Aβ-Spiegel in IL-17a-Wildtyp- Mäusen, aber nicht in IL-17a-defizienten APP-transgenen Mäusen; 5) Die Depletion von Darmbakterien förderte die Transkription des Arc-Gens im Gehirn von IL-17a-Wildtyp-, aber nicht von IL-17a-defizienten APP-transgenen Mäusen. Die Arc-Expression wird mit der Verbesserung der kognitiven Funktion in Verbindung gebracht. Zur weiteren Identifizierung möglicher Mechanismen, durch die die Depletion von Darmbakterien die Aβ-Pathologie reguliert, haben wir die folgenden Ergebnisse: 1) Die Depletion von Darmbakterien hemmte die β-Sekretase-Aktivität im Gehirn von IL-17a-Wildtyp-, aber nicht von IL-17a-defizienten APP-transgenen Mäusen, was möglicherweise zu einer verringerten Aβ-Produktion führte; 2) Die Depletion von Darmbakterien erhöhte die Expression von ABCB1 und LRP1 im Gehirn oder an der BHS von IL-17a-Wildtyp-, aber nicht IL-17a-defizienten APP-transgenen Mäusen. ABCB1 und LRP1 sind für den Aβ-Efflux durch die Blut-Hirn-Schranke verantwortlich; 3) Interessanterweise erhöhte bereits der Knockout des Il-17a-Gens die ABCB1- und LRP1-Expression an der Blut-Hirn-Schranke; 4) Die Depletion von Darmbakterien erhöhte nicht die mikrogliale Aβ-Phagozytose und den extrazellulären Aβ-Abbau im Gehirn von APP-transgenen Mäusen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Depletion von Darmbakterien die entzündliche Aktivierung und die Amyloid-Pathologie in APP-transgenen Mäusen über IL-17a-beteiligte Signalwege abschwächt. Unsere Studie trägt zu einem besseren Verständnis der Darm-Hirn-Achse in der Pathophysiologie der Alzheimer-Krankheit bei und unterstreicht das therapeutische Potenzial einer IL-17a-Hemmung oder einer spezifischen Depletion von Darmbakterien, die die Entwicklung von IL-17aexprimierenden T-Zellen stimulieren.