Determination of the intramembrane positioning of the UBXD8 protein in phospholipid bilayer membranes and lipid droplet monolayers by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy

Abstract

Lipid droplets (LDs) are ubiquitous cytoplasmic organelles that originate from the endoplasmic reticulum (ER). They are unique cellular organelles composed of a neutral lipid core surrounded by a phospholipid monolayer instead of a bilayer membrane. LDs regulate cellular lipid metabolism by storing neutral lipids and mobilizing them in response to fluctuating nutrient conditions. Impaired LD dynamics are associated with many metabolic diseases, such as diabetes, obesity, cardiovascular disease, and lipodystrophy. The LD proteome is crucial for regulating the biogenesis, function, turnover, and dynamics of LDs. Due to the phospholipid monolayer of LDs, protein targeting to LDs differs from protein targeting to organelles bound by a phospholipid bilayer. LD proteins commonly utilize hydrophobic hairpin regions, amphipathic helices, or lipid anchors to integrate into the phospholipid monolayer. However, the mechanisms governing the partitioning of hairpin proteins from the ER membrane to LDs remain poorly understood. A major requirement for these proteins is that they adopt a monotopic topology, enabling them to associate with both the bilayer membrane of the ER and the phospholipid monolayer of the LDs. A prevailing model proposes that ER-to-LD targeting of hairpin proteins occurs by passive lateral diffusion along the cytoplasmic ER leaflet during LD emergence from the ER by assuming similar membrane embedding in both the ER bilayer and the LD monolayer. Molecular dynamics (MD) simulations of the ERTOLD protein UBXD8, however, suggested two possible mechanisms for its ER-to-LD partitioning. In the first scenario, UBXD8 adopts a deeply inserted, closed V-shaped conformation in the ER bilayer and undergoes a structural rearrangement to a shallower, open V-shaped conformation upon partitioning to the LD monolayer. In the second scenario, UBXD8 adopts similarly shallow, open V-shaped conformations in both ER bilayers and LD monolayers. To experimentally distinguish between these two scenarios, the work in this thesis established a continuous wave electron paramagnetic resonance (cwEPR) spectroscopy-based approach to quantitatively determine the membrane penetration depth of UBXD8 in phospholipid bilayer and phospholipid monolayer membrane mimetics. This required adapting cwEPR power saturation measurements, which are well established for bilayer membrane mimetics, to the technically distinct environment of artificial LDs, thereby establishing a novel experimental framework to directly assess the intramembrane positioning of proteins in a phospholipid monolayer environment of LDs. The findings from this study revealed that UBXD8 is more deeply inserted in phospholipid bilayers than in LD monolayers. Together with complementary evidence from MD simulations, cysteine solvent-accessibility assays, and intramolecular crosslinking experiments, the work in this thesis demonstrates that UBXD8 undergoes major structural rearrangements during ER-to-LD partitioning. MD simulations further suggest that these rearrangements are unlikely to occur spontaneously. Together, these findings challenge the previously proposed passive lateral diffusion model for ER-to-LD protein partitioning and support a model in which conformational rearrangements of hairpin proteins provide a regulatory mechanism for differential protein recruitment to LDs. By providing quantitative experimental evidence that UBXD8 changes its intramembrane arrangement during ER-to-LD partitioning, this work provides novel mechanistic insight into the fundamental process of LD protein targeting and establishes a framework for future studies addressing whether lipid-mediated parameters or additional regulatory proteins acting as gatekeepers control ER-to-LD protein partitioning.

Lipidtröpfchen (LDs) sind ubiquitäre zytoplasmatische Organellen, die aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) hervorgehen. Sie sind einzigartige Zellorganellen, die aus einem Kern aus neutralen Lipiden bestehen, der von einer Phospholipid-Einzelschicht anstelle einer Doppelschichtmembran umgeben ist. LDs regulieren den zellulären Lipidstoffwechsel, indem sie neutrale Lipide speichern und diese in Reaktion auf schwankende Nährstoffbedingungen mobilisieren. Eine gestörte LD-Dynamik ist mit vielen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes, Adipositas, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Lipodystrophie assoziiert. Das LD-Proteom ist entscheidend für die Regulation der Biogenese, Funktion, des Abbaus und der Dynamik von LDs. Aufgrund der Phospholipid-Einzelschicht von LDs unterscheidet sich das Protein- Targeting zu LDs von dem zu Organellen, die von einer Phospholipid-Doppelschicht umgeben sind. LD-Proteine nutzen häufig hydrophobe Haarnadelstrukturen, amphipathische Helices oder Lipidanker, um sich in die Phospholipid-Einzelschicht zu integrieren. Die Mechanismen, die die Verteilung von Haarnadelproteinen von der ER-Membran zu den LDs steuern, sind jedoch noch weitgehend unverstanden. Eine wichtige Voraussetzung für diese Proteine ist ihre monotopische Topologie, die es ihnen ermöglicht, sowohl mit der Doppelschichtmembran des ER als auch mit der Phospholipid-Einzelschicht der LDs zu assoziieren. Ein gängiges Modell geht davon aus, dass das ER-zu-LD-Targeting von Haarnadelproteinen durch passive laterale Diffusion entlang der cytoplasmatischen ER-Membranschicht während des Austritts der LDs aus dem ER erfolgt, wobei eine ähnliche Membraneinbettung sowohl in der ERDoppelschicht als auch in der LD-Einzelschicht angenommen wird. Molekulardynamik- Simulationen (MD) des ERTOLD-Proteins UBXD8 legten jedoch zwei mögliche Mechanismen für dessen ER-zu-LD-Verteilung nahe. Im ersten Szenario nimmt UBXD8 in der ERDoppelschicht eine tief eingelagerte, geschlossene V-förmige Konformation an und erfährt beim Übergang in die LD-Einzelschicht eine Strukturumwandlung zu einer flacheren, offenen V-förmigen Konformation. Im zweiten Szenario nimmt UBXD8 sowohl in der ER-Doppelschicht als auch in der LD- Einzelschicht ähnlich flache, offene V-förmige Konformationen an. Um diese beiden Szenarien experimentell zu unterscheiden, wurde in dieser Arbeit ein auf kontinuierlicher Elektronenspinresonanz (cwEPR) basierender Ansatz entwickelt, um die Membranpenetrationstiefe von UBXD8 in Phospholipid-Doppelschicht- und Phospholipid- Einzelschicht-Membranmimetika quantitativ zu bestimmen. Dies erforderte die Anpassung von cwEPR-Leistungssättigungsmessungen, die für Doppelschicht-Membranmimetika etabliert sind, an die technisch unterschiedliche Umgebung künstlicher LDs. Dadurch wurde ein neuartiger experimenteller Rahmen geschaffen, um die intramembranäre Positionierung von Proteinen in einer Phospholipid-Einzelschichtumgebung von LDs direkt zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass UBXD8 tiefer in Phospholipid- Doppelschichten als in LD-Einzelschichten eingebettet ist. Zusammen mit ergänzenden Daten aus MD-Simulationen, Untersuchungen zur Lösungsmittelzugänglichkeit von Cystein und intramolekularen Crosslinking-Experimenten belegt die vorliegende Arbeit, dass UBXD8 während der Verteilung vom ER zu den LDs bedeutende Strukturveränderungen durchläuft. MD-Simulationen legen zudem nahe, dass diese Veränderungen wahrscheinlich nicht spontan erfolgen. Diese Ergebnisse stellen das bisher vorgeschlagene passive laterale Diffusionsmodell für die Verteilung von Proteinen vom ER zu den LDs in Frage und stützen ein Modell, in dem Konformationsänderungen von Haarnadelproteinen einen Regulationsmechanismus für die differenzielle Rekrutierung von Proteinen zu LDs darstellen. Durch den quantitativen experimentellen Nachweis, dass UBXD8 seine Struktur innerhalb der Membranwährend der Verteilung vom ER zu den LDs verändert, liefert diese Arbeit neue mechanistische Einblicke in den grundlegenden Prozess des LD-Protein-Targetings und schafft eine Grundlage für zukünftige Studien, die untersuchen, ob lipidvermittelte Parameter oder zusätzliche regulatorische Proteine, die als Türwächter fungieren, die Verteilung von Proteinen vom ER zu den LDs steuern.