Advancing miRNA Research: Computational Approaches for Single-Cell and Tissue-Resolved Analyses

Abstract

Since their discovery in 1993, microRNAs have been an active topic in molecular biology, a breakthrough that was honored with the 2024 Nobel Prize, reflecting their profound impact on the field. Despite the many years of research focused on microRNAs across species, their precise functional roles are still not fully understood. In particular, the dynamics behind timing and location of microRNA-mediated target repression or activation are yet to be discovered for most tissue and cell contexts. Moreover, these localized microRNA expression profiles are known to change throughout the lifespan of organisms. Recently, single-cell RNA sequencing has revealed age-modulated expression patterns such as waves of activation with exceptional detail by capturing cellular heterogeneity. Yet, the currently limited scalability and high costs involved with single-cell high-throughput microRNA protocols prevent large-scale, cell type-resolved application studies. As an alternative, fine-grained study designs which consider multiple tissues investigate microRNA expression heterogeneity with established bulk-sequencing protocols. Eventually, either approach results in large, multi-faceted datasets where computational methods are necessary to select promising microRNAs or identify behavior-driving sample properties, such as sex or age. To this end, this thesis presents a flexible computational framework for the downstream analysis of such complex microRNA datasets. Three publications investigating individual application scenarios of microRNA functionality emphasize the customizability of the developed framework. In the first, which explored small non-coding RNAs in two mouse plasma fractions, nonnegative matrix factorization of the expression profiles was used to cluster samples based on their age. Second, in a case-control study investigating the effects of non-thermal plasma treatment, differential expression analysis revealed a set of microRNAs previously implicated in wound healing and tissue regeneration. Third, a clustering of time-series data in stem cell differentiation identified increasing expression trajectories for genes related to cell-type differentiation. The adaptability of the computational framework was demonstrated by providing normalized count tables alongside detailed quality control metrics to optimize library preparation protocols for single-cell microRNA sequencing. Building upon this, the accessibility aspect of the framework was addressed with the development of a web-based platform to enable scientists world-wide to process and evaluate their sequencing runs, facilitating the rapid prototyping of single-cell microRNA preparation protocols. Applying the computational framework to large-scale, multi-faceted datasets resulting from fine-grained bulk studies highlighted its scalability. Investigating an organ-resolved expression dataset (771 samples from 16 organs across ten time points) revealed both organ-specific and global microRNA profiles. Examining these recurrent expression patterns at multiple time points across the mouse lifespan uncovered dynamic expression patterns influenced by aging. A subsequent study focussed on the mouse brain (844 samples from 15 brain regions across seven time points), which is characterized by its substantial structural and functional heterogeneity. By leveraging all aspects of the developed computational framework, including embedding, differential expression analysis, and clustering of time-series data, the study identified brain region-specific and global aging signatures within a sex-specific dataset. Further, in a unique case-control study which involved accommodating mice at the International Space Station for 40 days, a profiling of single-cell messenger-RNA expression levels revealed the down-regulation of ribosomal protein genes. Both, the analysis of the single-cell RNA and the associated bulk microRNA dataset showed effects of spaceflight on the extracellular matrix and the immune system. In the future, as more single-cell protocols become accessible and sequencing costs further decrease, fine-grained microRNA studies will be even more relevant. The computational framework presented in this dissertation provides a foundation for their analysis by offering customizable, adaptable, and scalable evaluation methods. Ultimately, these developments support the translation of findings to clinical applications, facilitate the development of intricate analysis methods, and therefore advance microRNA research.

Seit ihrer Entdeckung im Jahr 1993 sind microRNAs ein zentrales Thema der Molekularbiologie. Ihre Bedeutung für das Fachgebiet wurde mit der Verleihung des Nobelpreises für Medizin im Jahr 2024 gewürdigt. Trotz jahrelanger Forschung an microRNAs sind ihre genauen und umfassenden Funktionen jedoch noch nicht vollständig verstanden. Insbesondere die Dynamik der zeitlichen und räumlichen Regulation durch microRNAs ist in den meisten Gewebe- und Zellkontexten unklar. Bekannt ist hingegen, dass sich diese lokalisierten Expressionsprofile im Laufe des Lebens eines Organismus verändern. Kürzlich hat die RNA-Sequenzierung einzelner Zellen altersbedingte Expressionsmuster, zum Beispiel Aktivierungswellen, mit außergewöhnlicher zellulärer Auflösung sichtbar gemacht. Derzeit verhindern jedoch die begrenzte Skalierbarkeit und die hohen Kosten solcher experimenteller Protokolle für microRNAs deren breiten Einsatz in Anwendungsstudien. Alternativ dazu ermöglichen Studiendesigns, die aus mehreren Einzelgeweben bestehen, die Untersuchung der Heterogenität der microRNA-Expression mittels etablierter Bulk-Sequenzierungstechniken. Beide Ansätze führen zu großen und vielfältigen Datensätzen, die computergestützte Methoden erfordern, um vielversprechende microRNA-Kandidaten auszuwählen oder regulatorisch relevante Merkmale wie Geschlecht oder Alter zu identifizieren. In dieser Dissertation wird ein computergestütztes Framework zur Analyse solcher komplexer microRNA-Datensätze vorgestellt. Zunächst wird die Flexibilität des entwickelten Frameworks in drei Publikationen zu spezifischen Anwendungsfällen von microRNA-beeinflusster Funktionen demonstriert. In der ersten Studie wurden nichtkodierende RNAs in zwei Mausplasmen untersucht, wobei eine nichtnegative Matrixfaktorisierung der Expressionsprofile zur altersbasierten Clusterbildung der Proben verwendet wurde. In einer zweiten Fall-Kontroll-Studie, in der die Auswirkungen einer nicht-thermischen Plasmabehandlung betrachtet wurden, konnten durch differentielle Expressionsanalysen microRNAs identifiziert werden, die bereits mit Wundheilung und Geweberegeneration in Verbindung gebracht wurden. Eine Clusteranalyse von Zeitreihendaten zur Stammzelldifferenzierung in der dritten Studie ergab ansteigende Expressionsmuster von Genen, die an der Zelltypdifferenzierung beteiligt sind. Die Anpassungsfähigkeit des Frameworks wurde anhand eines Einzelzell-microRNA-Datensatzes demonstriert für den eine normalisierte Expressionstabelle und detaillierte Metriken zur Qualitätskontrolle erstellt wurden. Darauf aufbauend wurde die Zugänglichkeit des Systems durch die Entwicklung einer webbasierten Plattform verbessert, die es Forschern weltweit ermöglicht, ihre Sequenzierungsdaten zu analysieren und damit die schnelle Prototypisierung von Einzelzellprotokollen für microRNAs unterstützt. Die weitere Anwendung des Frameworks auf große und komplexe Bulk-Datensätze, die aus mehreren Geweben bestehen, unterstreicht seine Skalierbarkeit. Die Untersuchung eines hochaufgelösten Expressionsdatensatzes (771 Proben aus 16 Organen über zehn Zeitpunkte) zeigte sowohl organspezifische als auch globale microRNA-Profile. Durch die Analyse von wiederkehrender Expressionsmuster über mehrere Zeitpunkte konnten dynamische, altersabhängige Expressionsmuster nachgewiesen werden. Eine Folgestudie mit Fokus auf das Mausgehirn (844 Proben aus 15 Hirnregionen zu sieben Zeitpunkten) wurde durchgeführt, da dieses Organ eine erhebliche strukturelle und funktionelle Heterogenität aufweist. Unter Verwendung aller Aspekte des entwickelten Frameworks, einschließlich Einbettungsmethoden, differentieller Expressionsanalyse und Clusteranalyse von Zeitreihendaten, wurden in einer geschlechtsspezifischen Untersuchung des Datensatzes sowohl regionsspezifische als auch globale Alterungssignaturen identifiziert. Darüber hinaus wurde in einer einzigartigen Fall-Kontroll-Studie an Mäusen, die für 40 Tage an Bord der Internationalen Raumstation untergebracht wurden, mittels einer Einzelzell-mRNA-Expressionsanalyse eine Herunterregulierung ribosomaler Proteingene nachgewiesen. Zusammen mit der begleitenden Bulk-Analyse von microRNAs zeigte sie Effekte des Weltraumfluges auf die extrazelluläre Matrix und das Immunsystem. Mit der zunehmender Verfügbarkeit von Einzelzellprotokollen und sinkenden Sequenzierungskosten werden detaillierte microRNA-Studien in Zukunft an 7 Relevanz gewinnen. Das in dieser Dissertation vorgestellte computergestützte Framework bietet eine Grundlage für deren Analyse, indem es anpassbare, flexible und skalierbare Analysemethoden bereitstellt. Diese Entwicklungen unterstützen letztlich den Transfer von Forschungsergebnissen in die klinische Anwendung, ermöglichen die Entwicklung neuartiger Analysemethoden und tragen somit zur Forschung auf dem Gebiet der microRNAs bei.